Газожидкостный хроматографический анализ (ГЖХ) является наиболее эффективным методом разделения сложных смесей, в том числе лекарственных, в состав которых входят природные жирные кислоты. К преимуществам газовой хроматографии относятся: большая информативность (идентификация более 100 соединений за один анализ) и невысокая стоимость оборудования по сравнению с жидкостной хроматографией, и поэтому её рекомендуют для определения содержания биологически активных высших насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот (ВЖК) в лекарственных препаратах [1]. В тоже время, газожидкостная хроматография ВЖК представляет собой сложный и трудоёмкий процесс. Во-первых, это обусловлено тем, что ВЖК являются нелетучими соединениями, и их нужно переводить в метиловые эфиры. Во-вторых, анализу мешают углеводороды и другие нейтральные соединения. В-третьих, в процессе хроматографии с кислотами могут происходить сложные химические превращения, которые влияют на достоверность полученных результатов [2].
Наличие непредельных связей в ВЖК делает их неустойчивыми к высоким температурам, и это обуславливает их химическое взаимодействие с активными группировками твердых, жидких и газообразных фаз. Химические превращения жирных кислот могут происходить и в процессе пробоподготовки. Чтобы свести к минимуму ошибки в определении содержания ВЖК, для достоверности на практике применяют два параллельных хроматографических анализа на двух колонках с разными жидкими фазами и разными температурными режимами, а иногда используют разные пробоподготовки [2]. Работах, посвященных ГЖХ, можно найти описание методик, применяемых для разделения этих соединений, а также рекомендации по приготовлению метиловых эфиров жирных кислот [3].
Целью данного исследования явилось сравнение результатов состава высших жирных кислот в лекарственном препарате «Омеганол», полученных разными методами ГЖХ и, в частности, с применением в хроматографии модифицированной мелкодисперсным кварцем неподвижной фазы. Для этого применены два разных метода газожидкостной хроматографии и разные пробоподготоки, наиболее часто употребляемые в исследованиях лаборатории хроматографии РостГМУ.
Метод I. Ускоренный способ. Время пробоподготовки и хроматографии 11-13минут.
Пробоподготовка. Прямое метилирование природных эфиров жирных кислот. При приготовлении метиловых эфиров ВЖК в образец исследуемого препарата добавляют гексан, а через 5 минут раствор метилата натрия (2 моль/л) в метиловом спирте. Через 1 минуту получают метиловые эфиры, которые находятся в верхней гексановой фазе. При данной методике метилируются только природные эфиры высших жирных кислот. Следует отметить, что присутствие в образцах влаги недопустимо.
Условия хроматографии. Хроматограф «Цвет - 800». Медная капиллярная колонка с модифицированной неподвижной фазой, содержащей полидиэтиленгликольадипат и 5% мелкодисперсный кварцевый наполнитель. Длина колонки - 10м, внутренний диаметр колонки - 0,22 мм. Данные колонки изготавливают на базе лаборатории хроматографии РостГМУ с применением динамического метода нанесения неподвижной фазы. Газ-носитель: водород. Температурный режим термостата 1820С. Температура испарителя и детектора 2200С. Проба вводилась без растворителя с помощью модифицированного шприца МШ-1 и без деления потока газа - носителя.
Метод II. Время пробоподготовки и хроматографии 150-180 минут. Пробоподготовка. Метод предварительного гидролиза природных эфиров ВЖК. Исследуемый образец выдерживают в водном растворе KOH (2 моль/л) при температуре 1000С в течение 10 минут, затем проводят экстракцию гексаном соединений, мешающих анализу ВЖК. Раствор калиевых солей жирных кислот подкисляют водным раствором соляной (2моль/л) кислоты до рН 1. Свободные жирные кислоты экстрагируют пентаном, который затем упаривают в токе сухого азота. Свободные ВЖК метилируют раствором концентрированной серной кислоты (УЧ /, 0,7 моль/л) в метаноле при температуре 680С в течение 60 минут. Полученный раствор обрабатывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия до рН 10, и готовые для хроматографии эфиры ВЖК экстрагируют пентаном. В приведённом методе приготовления эфиров кислот допустимо содержание влаги.
Условия хроматографии. Хроматограф «Кристалл - 5002». Колонка капиллярная кварцевая. Длина - 100 м, внутренний диаметр - 0,25 мм. Газ-носитель: азот глубокой очистки. Температурный режим хроматографии: программированный с 1400С до 2200С, скорость подъёма температуры 40 град/мин. Температура испарителя и детектора 2400С. Проба вводилась в пентане с делителем потока газа-носителя. Результаты хроматографии по первому и второму способам приведены ниже. В первом способе количество идентифицированных соединений — 16, процентное содержание кислот : (2.738%С14:0; 0.025%С14:1;0,203%С15:0; 0,080% С15:1; 11,439%С16:0; 3,515%С16:1; 0,128%С17:0; 0,319%С17:1; 2,825%С18:0; 55,147%С18:1; 12,137%С18:2; 1,763%С18:3; 0,237%С20:0; 1,271%С20:1; 0,593%С20:4; 7,612%С22:6.). Подстрочный индекс обозначает количество атомов углерода в кислоте и число непредельных связей соответственно.
Во втором способе идентифицировано 33 кислоты с процентным содержанием кислот : (0,012%С10:0; 0,004%С11:0; 0,138%С12:0; 0,012%С13:0; 2,602% С14:0; 0,027%С14:1; 0,180%С15:0; 0,007%С15:1; 10,503%С16:0; 3,294%С16:1; 0,116%С17:0; 0,367%С17:1;2,456%С18:0; 0,963%С18:1 n 9 trans; 45,164%С18:1 n 9 cis; 1,115%С18:2 n 6 trans; 9,364%С18:2 n 6 cis; 0,196%С20:0; 0,102%С18:3 n 6; 1,193%С20:1; 1,411%С18:3 n 3; 0,028%С21:0; 0196%С20:2; 0,074%С22:0; 0,079%С20:3 n 6; 0,315%С22:1 n 9 + С20:3 ; 3;0,472%С 20:4 n 6; 0,024%С23:0; 0,026%С22:2; 6,735%С20:5 ; 3;0,032%С24:0; 0,186%С24:1; 6,137%С22:6 n 3). При подсчёте процентного содержания кислот во втором способе проводился пересчёт на кислоты, идентифицированные по первому способу. Результаты следующие: (3,038%С14:0; 0,032%С14:1; 0,210%С15:0; 0,008%С15:1; 12,261%С16:0; 3,845%С16:1; 0,135%С17:0; 0,428%С17:1; 2,867%С18:0; 53,850%С18:1; 12,233%С18:2; 1,755%С18:3; 0,229%С20:0; 1,393%С20:1; 0,551%С20:4; 7,164%С22:6).
Разница в отклонениях между кислотами в первом и во втором способах по количественному составу высших жирных кислот наблюдались в пределах статистической достоверности. Например, содержание полиненасыщенных кислот С22:6 по первому способу - 7,612%, а по второму - 7,164%, и соответственно для С24:0 0,593% и 0,551%, т.е. отклонения входят в 10% погрешность рекомендуемых при хроматографии на капиллярной колонке. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что применение двух разных методик при приготовлении метиловых эфиров высших жирных кислот и проведение газохроматографического анализа на двух разных колонках не приводят к достоверным отклонениям по процентному содержанию ВЖК.
Сравнивая ГЖХ анализы на короткой колонке с неподвижной фазой, в состав которой входит мелкодисперсный кварц и на 100метровой импортной колонке, можно отметить экономию времени в первом случае. Существенным недостатком первого метода является невозможность получения информации по cis- и trans- изомерам жирных кислот. Исходя из приведённых данных, установлена возможность использования двух методов хроматографии в определении качества препаратов на содержание высших жирных кислот.
ЛИТЕРАТУРА
- Ю.В. Шостенко, А.Т. Шеин. Прикладная хроматография. М., Мир, 1984.
- Э. Хефтман. Хроматография: Практическое приложение метода. М. Наука, 1986.
- Р.Т. Тогузова. Хроматография в биологии и медицине. М., Наука, 1986