Выделение новых штаммов цианобактерий и их консорциумы с микроводорослями

Насущной задачей земледелия является его экологизация, которая включает использование ресурсов почвы для сохранения и увеличения их плодородия. Подходы к решению задачи, в част­ности, заключаются в использовании микробной компоненты почвы. Привлекательна в этом пла­не непременная и многочисленная группа фото-трофных микроорганизмов - цианобактерий. Прежде всего, внимание к ним привлечено бла­годаря азотфиксации и широкому спектру адап­тации к различным почвенным и гидротермиче­ским условиям. В связи с этим начато изучение возможностей использования цианобактерий как консортов сложных микробных сообществ. Цианобактерии могут образовывать стойкие консорциумы с микроводорослями [1, 2, 3, 4].

Целью данной работы было исследование и идентификация цианобактерий, выделенных из рисовых чеков Карауктибинского опорного пункта Казахского НИИ рисоводства им. Ибрая Жахаева Кызылординской области и создание на их основе консорциумов для получения эф­фективных биопрепаратов используемых в агро-биотехнологии. 

 Материалы и методы исследований

Объект исследований для данной работы по­служили пробы, отобранные на рисовых полях Карауктибинского опорного пункта Казахского НИИ рисоводства им. Ибрая Жахаева Кызылор-динской области, а также водные пробы из Ис-сыкского озера и с горячего источника Тургень Енбекшиказахкого района Алматинской области.

А также использовали штаммы Chlorella vulgaris Z-1, Ankistrodesmus falcatus взятые из коллекции лаборатории фототрофных микро­организмов кафедры биотехнологии Казахского Национального Университета им. Аль-Фараби.

Полевые наблюдения и сбор материала про­изводили с марта по июнь 2012 г.

На одном и том же участке производился от­боров проб с различной глубины. Отобранные пробы были доставлены в лабораторию с соблю­дением всех требований к перевозке отобранно­го материала.

Определение видового состава микроводо­рослей в пробах из различных водных экосистем проводили по методике Сиренко с использова­нием определителей для сине-зеленных водо­рослей [5, 6, 7, 8].

Для выделения альгологически чистой куль­туры из накопительной использовали обычные микробиологические методы - разделения, пе­ресевов. Для оценки активности водорослей ис­пользовались альгологически и бактериологиче­ски чистые формы [9, 10].

Для проверки на чистоту, культуры пересе­вались на стерильный 0,25 % мясной бульон. По помутнению бульона определяли чистоту куль­туры.

Определение оптической плотности и ди­намику роста на разных синтетических средах проводилось в течении 7 суток на спектрофото­метре PD-303 (Япония). Микрофотосъемка про­изводилась на цифровой фотоаппарат CANON PowerShot A 800 Silver. 

Результаты исследований и обсуждение

В ходе проведенных исследований были вы­делены 4 бактериологически чистые культуры цианобактерий, которые идентифицированы как представители родов Anabaena sp^-1, Spirulina sp.K-1,Oscillatoria sp.K-1 и Nostoc sp.K-1.

1.Nostoc sp.K-1

Относится к группе цианобактерий, класс Hormogeneae, порядок Nostocales, род Nostoc. Трихомы одиночные, прямые, состоят из ша­рообразных клеток, среди которых встречаются гетероцисты и реже акинеты. Для культивирова­ния используется среда Громова. Хорошо растут при температуре 250-300С. (1-рисунок, а).

Морфология культур Noctoc sp. K-1 (а) и Spirulina sp. K-Цв)

  2. Spirulina sp.K-1 

По систематическому положению относятся к цианобактериям, класс Hormogeneae, род Spi-rulina. нитчатые. Клетки образуют правильные спирали. Трихомерысветлые, сине-зеленые, их диаметр 1-2 мкм, расстояние между спиралями 2,7-5 мкм. В основном, растут, образуя скопле­ния на стенках посуды. Хорошо растут при тем­пературе 250-300С в среде Заррука на свету (1-ри-сунок, в).

Морфология культур Oscillatoria sp. K-Ца) и Anabaena sp. K-Цв)

 3.Oscillatoria sp. K-1 

Трихомы синевато-зеленого цвета, прямые, у поперечных перегородок не перешнурованные, к концам не утонченные, длина больше ширины. Выделены на питательной среде Громова. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250-280С (2-рисунок, а).

 4. Anabaena sp. K-1

 Относится к группе цианобактерий, класс Hormogeneae, порядок Nostocales, род Anabaena. Трихомы одиночные, очень часто в клубках, со­стоят из шарообразных клеток, среди которых встречаются гетероцисты и реже акинеты. Три­хомы своим строением очень напоминают три­хомы ностока. Большей частью они спирально или кольцеобразно свернуты, реже прямые. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250-300С (2-рисунок, в).

Влияние азота на рост выделенных штам­мов цианобактерий

В дальнейшем, с целью проведение скринин­га полученных бактериологически чистых куль­тур цианобактерий по способности азотфикса-ции, все выделенные культуры цианобактерий выращивали на среде Громова без добавления источника азота. Для этого изучалось влияние данного элемента на их динамику роста.

Результаты опыта показали, что из всех выделенных цианобактерий (Spirulina sp.K-1, Anabaena sp.K-1, Oscillatoria sp.K-1) наиболь­шей активностью роста клеток обладает куль­тура Anabaena sp.K-1 (3-рисунок). Рост клеток культур Spirulina sp. K-1 , Oscillatoria sp. K-1 в среде без азота был на много ниже в сравнение с ростом культуры Anabaena sp.K-1.

Экспериментальные данные свидетель­ствуют о высокой продуктивности культуры Anabaena sp.K-1 на питательной среде, без до­бавления азота. При сравнении роста культур Spirulina sp. K-1 и Oscillatoria sp.K-1 на двух средах показано, что на среде с отсутствием азота наблюдается наименьший прирост биомассы. Полученные результаты позволяют предпола­гать, о том, что культура Anabaena sp.K-1 полу­чает азот путем его связывания из атмосферы. Штамм Anabaena sp.K-1 характеризуется высо­кой скоростью роста в безазотистой среде, что коррелирует с большой частотой образования гетероцист и высокой активностью нитрогеназы.

Влияние азота на динамику роста цианобактерий

Известно что, цианобактерии - одни из не­многих живых существ, способных фиксировать атмосферный азот, переводя его в доступную для всего живого форму.

Использование в агробиотехнологии азото-фиксирующих цианобактерий может решить проблемы структуризации, плодородия почв, соответственно, увеличить урожайность сель­скохозяйственных растений. 

Влияние рН среды на рост клеток циано-бактерии Anabaena sp.K-1

Цианобактерии подвергаются воздействию целого ряда экологических факторов, важней­шими из которых являются температура, pH и реакция среды.

Для достижения высоких результатов при культивировании цианобактерий показатель рН среды должен быть оптимальным для их роста. При приготовлении питательных сред необхо­димо вести контроль за концентрацией ионов водорода. Кислотность воды является лимити­рующим фактором. Устойчивость разных так­сонов к изменениям кислотности различна. Для многих цианобактерий характерна нейтральная либо слабощелочная среда, оптимальный пока­затель рН среды составляет 7,0 -7,6. Кислотность среды влияет на устойчивость компонентов пи­тательной среды, на их доступность для живых организмов, в особенности на усвояемость фак­торов роста, витаминов.

Изучено влияние реакции среды в диапазоне от 2 до 10 с интервалом 2 на клетки цианобак-терии Anabaena sp. К-1.Культуру цианобактерии выращивали на жидкой питательной среде Гро­мова. Необходимые для эксперимента значения рН получали с использованием концентриро­ванной щелочи (КОН) или кислоты (НС1). При определении использовали рН метр. Градиент рН в незабуференной среде задавали в начале опыта и далее не корректировали.

Результаты испытаний роста штамма циано-бактерии на питательных средах с разными зна­чениями рН показали, что оптимальное значение рН для исследованной культуры составляет в пределах 6-8 (4-рисунок).

При значении рН среды 2 наблюдалось пол­ное разрушение клеточного содержимого. Сдвиг рН среды в сторону подщелачивания от 2 до 4 и от 8 до 10 вызывали изменение формы у 50­60% клеток с эллипсоидной на круглую, повреж­дения клеточных стенок, а также происходило обесцвечивание цитоплазмы. В диапазоне рН от 6 до 8 клетки сохраняли морфологический ста­тус (5-рисунок).

Интенсивность роста культур цианобактерии Anabaenа sp. К-1 при различных значениях рН среды

Таким образом, область значений рН от 6 до 8 была наиболее оптимальной для роста клеток

Anabaena sp. К-1, при изменении рН среды в сто­рону кислой среды наблюдалось изменение мор­фологии клеток. А при рН свыше 8 число непод­вижных, разрушенных клеток резко возрастало.

Динамика роста клеток Anabaena питательной среде Громова при различных значениях рН

Создание консорциума цианобактерий и микроводорослей, определение их динамики роста

Для создания консорциумов выбрана азот-фиксирующия цианобактерия с наибольшей азотфиксирующей активностью Anabaena sp. К-1. И взяты три культуры микроводорослей Nos-toc calsicola, Ankistrodesmus falcatus и Chlorella vulgaris из коллекции лаборатории фототрофных микроорганизмов     кафедры биотехнологии

Казахского Национального Университета им. Аль-Фараби.

Вначале исследовали динамику роста всех четырех культур в течении 7 суток.

Из таблицы видно, что максимальный прирост биомассы на седьмые сутки культивирования наблюдался у культуры микроводорослей Chlo-rella vulgaris. Чуть меньше Nostoc calsicola и Anabaena sp. Были созданы четыре ассоциации Nostoc calsicola - Ankistrodesmus falcatus и Nostoc calsicola - Chlorell vulgaris; Anabaena -Ankistrodesmus falcatus и Anabaena - Chlore-lla vulgaris. Консорциумы цианобактерий и микроводорослей выращивались в течении 7 суток.

Динамика роста цианобактерийи микроводорослей

Из рисунка 6 видно, что Ankistrodesmus falca-tus сильно подавляет рост цианобактерий. Хоро­ший рост показали два консорциума^^^ cal-sicola - Chlorella vulgaris и Anabaena - Chlorella vulgaris.

Особая ценность этих консорциумов в том, что штаммы Anabaena sp. К-1 и Nostoc calsicola защелачивают среду до рН 8 ,а под действием микроводоросли Chlorella vulgaris рН менялась в сторону нейтральной, при культивировании консорциума Nostoc calsicola - Chlorella vulgaris через 3 суток, а консорциума Anabaena sp. К-1 -Chlorella vulgaris через 4 суток.

Было проведено микроскопическое исследование искуственного консорциума на основе цианобактерий и зеленых водорослей их морфологии (7-рисунок). Показана возможность консорциумов при совместном культивировании исследуемых штаммов.

 

Динамика роста консорциумов цианобактерий и микроводорослей

 Таким образом созданы два новых консорциума цианобактерий и микроводорослей (Anabaena sp. - Chlorella vulgaris и Nos-toc calsicola с- Chlorella vulgaris), которые могут быть предложены для использования в агробиотехнологии для обогащения почв связанным азотом, а также для регуляции рН среды (нейтрализации).

Морфология культур в искуственных консорциумах Anabaena sp. с Chlorella vulgaris (а, б) и Nostoc calsicola с Chlorella vulgaris (г ,д)

Литература

  1. Панкратова Е.М., Калинин А.А. Цианобактерии как возможные организмы для создания бакте­риальных препаратов // Роль научн. исслед. в развитии сельского хозяйства. производства Кировской области. Киров, 1991. - С.25-33.
  2. Калинин А.А. Цианобактерии как возможные компоненты дизатрофных микробных ассоциаций и их влияние на растения: Автореферат.дисс. канд.биол. наук. М., 1995. - 23 с.
  3. Ковина А.Л. Микробные агроконсорциумы на основе цианобактерий: Автореферат.дисс. канд. биол. наук М., 2001.-23 с.
  4. Панкратова Е.М., Зяблых Р.Ю., Калинин А.А., Ковина АЛ., Трефилова Л.В. Конструирование микробных культур на основе синезеленой водоросли Nostocpa1udosumKiitz.il Альгология,2004. Т.14 №4.-С.445-458.
  5. Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наука думка, 1975. -247с.
  6. Эргашев А.Э. Определитель протококковых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1979. -Ч.І. - 343с.
  7. Эргашев А.Э. Определитель протококковых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1979. -Ч.ІІ. -383с.
  8. Овсеникова М. Н. Методы получения бактериологически чистых культур одноклеточных зеленых водорослей // Бот.журн. - 1971. - №58. - С.1141-1147.
  9. Заядан Б.К., Өнерхан Г. Микробалдырлардың таза дақылдарын бөліп алу және оларды белсенді өсіру тәсілдері. - Көкшетау, 2008. - 95 б.
  10. Заядан Б.К., Акмуханова Н.Р., Садвакасова А.К Коллекция микроводорослей и методы их культивирования. - Алматы, 2013. - с. 158.
Фамилия автора: Б.К. Заядан, Г.Б. Баймаханова, Г. Ораз, К. Болатхан, Е.В. Зенина
Теги: Бактерии
Год: 2013
Город: Алматы
Категория: Экология
Яндекс.Метрика