Влияние длительного воздействия низких доз фипронилана окислительный стресс беременных крыс и их потомства

АННОТАЦИЯ

В работе изучена эффект длительного воздействия низких доз фипронила (ФПН)на состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) беременных крыс и их потомства. Было установлено, что длительное воздействие низких доз ФПН, приводит к окислительному стрессу (ОС) у беременных крыс и их потомства. У крыс максимальное увеличение уровня малонового диальдегида в качестве основного показателя ПОЛ, обнаружены на 14-21 дни беременности. Это сопровождалось заметным сокращением активности каталазы, одной из важных систем АОЗ. Аналогично, ОС у потомства вызванное, фипронилом, максимально проявляется на 7-14 дни после родов, в период кормления молоком. Степень ОС у потомства уменьшается после прекращения приема пестицида или его метаболитов через грудное молоко.

Ключевые слова: развитие токсичности, фипронил, потомство, окислительный стресс, беременность.

Введение.

Фипронил (ФПН) является N-фенилпиразол инсектицидом, который широко используется для борьбы с вредителями в сельском хозяйстве, здравоохранении, и дома. ФПН зарегистрирован и применяется для борьбы с вредителями кукурузы, хлопка и риса в различных частях мира. Рост использования ФПН содержащих инсектицидов, способствует к ограничению применения известных хлорорганических и фосфорорганических пестицидов [22].

Первоначально предполагалось, что из-за избирательного действия ФПН является относительно безопасным для организма млекопитающих и человека [10; 11]. Однако

последующие исследования показали, что фенилпиразол содержащие инсектициды, в том числе ФПН, может оказать высокое общее цитотоксическое воздействие на позвоночных и млекопитающих. Степень токсичности зависит от дозы, способа и продолжительности действия. Имеются достаточные данные о цитотоксическом эффекте ФПН на организм в естественных условиях и в in vitro. На моделях в пробирке с клетками нейробластомы человека SH-SY5Y было показано, что ФПН индуцирует апоптоз нейронов, опосредованную повышенной генерацией активных форм кислорода, то есть через окислительный стресс [13; 14].

В исследованиях на моделях в пробирке PC12 феохромоцитомы в нейротипических клетках крыс также было показано, что ФПН ингибирует ДНК и синтез белка в недифференцированных клетках и вызывает окислительный стресс в большей степени, чем хлорпирифос, что приводит к снижению количества клеток, даже если жизнеспособность клеток сохраняется [16]. Лечение антиоксидантами в этих случаях (витамин Е и аскорбиновая кислота) помогло снизить степень ОС, но не предотвратилгибель клеток [20]. Токсический эффект ФПН в естественных условиях, в основном вызванное ОС, были также обнаружены у крыс, мышей, рыб карп, зеленых лягушках и у других животных [7; 8; 18]. Также были описаны несколько случаев острого отравления людей с ФПН [15; 17].

Таким образом, в настоящее время можно считать доказанным роль ФПН в развитии ОС и связанное с этим токсическое воздействие его на организм позвоночных и млекопитающих. Тем не менее, большинство из этих исследований были проведены на клеточных моделях в пробирке, где были применены достаточно высокие концентрации ФПН. Использование клеточных моделей в токсикологии имеет свои очевидные преимущества. Тем не менее, она не в состоянии выявить многие аспекты проблемы метаболизма и фармакокинетики токсина связанных с его длительным воздействием [16].

Особую озабоченность вызывают токсические эффекты у беременных женщин и детей, потому что окислительный стресс развивающегося организма может оказывать вредное воздействие на нервную систему и привести к неблагоприятным неврологическим последствиям [9; 20]. Установлено, что городская дренажная система выступает в качестве непосредственного источника загрязнения пестицидами в городских сточных водах, и в этом случае фипронил и его метаболиты являются новыми и широко распространенными загрязнителями с потенциалом экотоксического индикатора. Всвязи с этим, беременные женщины и дети представляют собой группу повышенного риска в [5]. К сожалению, информация о состоянии ПОЛ и системы АОЗ при длительном воздействии низких доз ФПН, особенно на беременность млекопитающих, в литературе недостаточно освещена. В связи с этим мы в настоящей работе исследовали влияние длительного воздействия низких доз ФПН на состояние ПОЛ и АОЗ беременных крыс и их потомства.

Материалы и методы.

Фипронил (ФПН) в виде 4% концентрата эмульсии (торговая марка "Вигор") получили из совместной Узбекско-Германской коапании «Евро-Теам». Эксперименты проводились на белых взрослых девственных крысах самках Вистар массой тела 150-170г, половозрелые крысы самцы использовались только для оплодотворения. Все крысы содержались в условиях регулируемой температуры (22±30 С) и влажности с 12 часовым день-ночь циклом. Животные находились на обычном лабораторном рационе питания и воду получали без ограничений. Крысы были акклиматизированы в течении одной недели перед опытами. Затем крысы самки были разделены на две группы по 45 крыс в каждой. Первой группе крыс (обработанной) вводили через рот с использованием зонда разбавленный в физиологическом растворе фипронил из расчета 3,6 мг/кг/ежедневно. Это соответствовало 1/100 части от ЛД50 препарата. Вторая группа (контрольная) таким же способом получала такой же объем (3,6 мг/кг/ежедневно) стерильного физиологического раствора. Введение ФПН не прекращалось вплоть до окончания опытов. На 31 день опытов самки обоих групп соединялись с самцами для оплодотворения. Наступление беременности контролировали по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. После наступления беременности самки отделены от самцов и помещены в отдельные клетки для дальнейших исследований. Часть беременных самок обоих групп были умерщвлены на 14 и 21 дни (ГД 14 и ГД 21) беременности под легким эфирным наркозом. Другие крысы были умерщвлены таким же способом на 14 и 21 дни (ЛД 14 и ЛД 21) после родов.

Следует отметить, что длительное применение низких доз ФПН не привело к появлению явных симптомов отравленияу экспериментальных крыс. Только у некоторых крыс были обнаружены легкая вялость и незначительное снижение двигательной активности. Потомство от обработанных ФПН самок по количеству и размерами существенно не отличалось от контроля. Отмечено лишь некоторое запоздалое открывание глаз и отлипания ушей по сравнению с контролем. Потомство от обеих групп животных было умерщвлено на 7, 14, 21 и 30 дни после рождения, также под легкой анестезией эфиром. После умерщвления печень немедленно была извлечена, взвешена и очищена от посторонних тканей и промыта холодным физиологическим раствором. Для получения экстракта 1 г печени был гомогенизирован в 10 мл холодного раствора фосфатного буфера (рН 7,4). Гомогенат центрифугировали при 8000 об/мин в течении 15 мин при 40С, полученный супернатант использовали для биохимических исследований. Биохимическое определение состояния ПОЛ и уровня антиоксидантных ферментов проводили по известным методам, принятым в наших лабораториях [12].

Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли на основании реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБА) с образованием окрашенного комплекса (ТБАРС), который затем вычислялся спектрофотометрически и выражали в нмоль/мг белка. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли спектрофотометрически с использованием нитросинеготетразолия в качестве индикаторного реагента и выражали в усл.ед/мин.мг белка. При определении активности каталазы (КАТ) в качестве субстрата использовали перекись водорода, активность КАТ выражали в H2O2 /мин.мг белка.

Расчет и статистический анализ проводился с использованием статистического пакета для Windows. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение (СО). Все цифровые данные обрабатывали по критериям Фишера-Стьюдента; достоверными считались различия, удовлетворяющие Р<0,05.

Результаты и их обсуждение.

Полученные данные показали, что длительное воздействие низких доз ФПН приводит к значительной индукции ОС у крыс-самок (рис. 1). У крыс самок, которые до беременности в течении месяца получали ФПН, уровень МДА в 3,4 раза больше, чем в контрольной группе. Сама беременность также способствовала большей индукции ОС. У контрольных крыс, не получавших ФПН, на 14 и 21 дни беременности отмечено только небольшое повышение уровня МДА по сравнению с данными полученными до беременности. В отличие от этого, у обработанных ФПН самок уровень МДА в эти же дни, соответственно, были 4,3 и 4 раза выше, чем контрольные значения (р<0,001). После родов, уровень МДА, хотя в целом несколько ниже, но все еще 3,5-4 раза выше, чем контрольные значения.

Несколько иные результаты были получены в исследованиях антиоксидантных ферментов (рис. 2 и 3). Активность СОД и КАТ у обработанных ФПН крыс самок до беременности были более чем в 2,5 раза выше по сравнению с контролем. С 14 дня беременности, как правило, снижалась активность обоих ферментов, и на 21 день выявлено их значительное снижение по сравнению с контролем. После родов активность этих ферментов вновь повышалась и на 21 сутки лактации были более чем в 2 раза выше, чем контрольные значения. Длительное воздействие низких доз ФПН в значительной мере способствовало индукции ОС не только в материнском организме, но и у их потомства (рис. 4).

Уровень МДА у потомства ФПН крыс постепенно увеличивался и максимальное значение МДА наблюдалось на 14 день после рождения. Впоследствии уровень МДА постепенно уменьшался и к 30 дню после рождения достоверно не отличался от показателей контроля. Активность обоих СОД и КАТ на 7 день после рождения были более чем в 2 раза выше по сравнению с контрольным значением (рис. 5 и 6). На 14 день отмечено уменьшение показателей обоих ферментов, хотя их активность оставалась значительно выше по сравнению с контролем. На день 21 вновь отмечено повышение активности обоих ферментов примерно до уровня 7 дня после рождения. На 30 суткипосле рожденияактивность обоих ферментов значительно снижалась. Тем не менее, в этот период активность СОД не отличалась от контрольных значений, в то время как активность КАТ оставалась значительно выше по сравнению с контролем. Индукция ОС включает в себя чрезмерную продукцию активных форм кислорода (АФК и свободных радикалов) в результате дисбаланса между генерацией АФК и антиоксидантов. Антиоксидантные ферментные системы защиты включают в себя супероксиддисмутазу (СОД), каталазу (КАТ), лутатионпероксидазу (ГПс) и другие, которые могут защитить систему от вредного воздействия свободных радикалов кислорода. Повреждение мембранных липидов, белков и ДНК является конечным биомаркером ОС, вызванного действием многих пестицидов [23].

Индукция ОС является одним из основных механизмов действия многих пестицидов [1; 6]. Фипронил в определенных дозах и условиях также является мощным индуктором ОС [20]. В исследованиях в пробирке T.L.Lessiteretal., [16], показали, что ФПН является по своей природе более мощным разрушителем нейронов, чем хлорпирифос. Таким образом, в развивающихся клетках повышается восприимчивость их к фипронил-индуцированному ОС, даже антиоксидантное лечение никак не защищает этих клеток от гибели. Исследования у эмбрионов показало, что незрелая нервная система может быть особенно чувствительна, к негативному воздействию на структуру и функцию с повреждением рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) [21]. B.Clasen etal., [7] исследовали антиоксидантное состояние, ОС и параметры роста карповых рыб подвергшихся действию фипронила на рисовых полях. Было выявлено, что инсектицид фипронил вызывает изменения биохимических параметров в различных тканях карпа, не затрагивая рост или выживание рыбы.

К сожалению, в доступной нам литературе мы не нашли исследований о влиянии ФПН на беременные млекопитающие. По нашим данным, длительное воздействие низких доз ФПН в течение 30 дней до беременности значительно увеличивает ОС. Беременность способствует дальнейшей индукции ОС. Наиболее выраженный фипронил-индуцированный ОС выявлено на 21 день беременности, когда уровень МДА во много раз выше, чем контрольные параметры. По данным D.Hainzlet.al [11], несмотря на высокий уровень МДА и СОД у кошек на 21 день беременности показано значительное снижение ферментной активности по сравнению с контрольной группой. Наряду с этим, в контрольной группе крыс в течение беременности, мы обнаружили, тенденцию к снижению активности ферментов антиоксидантной защиты печени раньше, чем по сравнению с беременными крысами. Известно, что физиологическая беременность сопровождается образованием большого количества свободных радикалов, в основном активных форм кислорода (АФК). Беременность характеризуется высокими показателями АФК во время эмбрионального и фетального развития плаценты [5].

Обычно, в этих условиях, организм вынужден мобилизовать антиоксидантные ферменты из печени в другие органы, которые нуждаются в дополнительной антиоксидантной защите, в первую очередь, к плаценте. По нашим данным после родов активность антиоксидантных ферментов снова увеличивался, и на 21-й день лактации было значительно выше по сравнению с контрольными показателями. Всё это показывает, что интоксикация во время беременности приводит к дисбалансу между молекулами прооксидантного, в том числе реактивного кислорода и азота, а также антиоксидантной системы защиты, которая может играть ключевую роль в патогенезе различных осложнений беременности, таких как самопроизвольный аборт, невынашивание, и преэклампсии [2].

При воздействии ФПН, мы не отметили сокращения числа потомков, или угрозу выкидыша или других явных признаков нарушения беременности. Потомки самок, получавших ФПН, по количеству и размеру существенно не отличаются от контрольных. Отмечено лишь некоторое запоздалое открывание глаз и отлипания ушей по сравнению с контролем. Но это не значит, что фипронил-индуцированный ОС не оказывает на дородовое и послеродовое развитие потомства. Эпидемиологические исследования показали, что изменения в нервной системе, полового развития, распространенность астмы и аллергии во многих случаях связаны с воздействием загрязнителей на ранних этапах жизни [19]. Ранний постнатальный период является наиболее уязвимым к действию вредных факторов окружающей среды [3;4].

У потомства от матерей с длительным воздействием ФПН, мы также наблюдали значительную индукцию уровня ОС. МДА у потомства постепенно увеличивался, и его максимальное значение наблюдалось на 14 день после родов. Затем уровень МДА постепенно уменьшался и на 30 сутки постнатального периода существенно не отличался отконтрольного. Это означает, что ОС, который возник еще в эмбриональном периоде, продолжает развиваться в послеродовом периоде жизни. ОС снижается по мере прекращения поступления пестицида, или его токсичных метаболитов через грудное молоко. Этим объясняется снижение уровня МДА и активности СОД и КАТ на 30 сутки после рождения, когда полностью прекращается поступление ФПН или его метаболитов.

ОС во время беременности может играть ключевую роль в патогенезе многих заболеваний потомства, которых можно наблюдать в разные периоды постнатальной жизни [5; 19; 24]. Наши исследования ясно показали развитие выраженного ОС у потомства, когда на организм матери действует малые дозы ФПН во время беременности и в период лактации. Конечно, пренатальный и ранний постнатальный ОС может вызвать различные нарушения дальнейшего развития органов и систем, особенно нервной, эндокринной, репродуктивной и иммунной систем потомства. Наши результаты подтверждают мнение других исследователей и указывают на необходимость проведения гораздо более интенсивных исследований последствий воздействия ФПНна развитие плода и новорожденного в естественных условиях [20]. Важное значение имеет разработка эффективных методов профилактики и лечения возможных будущих негативных последствий дородового и послеродового воздействия ФПН на потомство.

Заключение.

Длительное воздействие низких доз ФПН, приводит к ОС у беременных и у их потомства. Самый высокий уровень ПОЛ у беременных связано с пониженной активностью ферментов антиоксидантной (СОД и КАТ). У потомства более высокий уровень ОС наблюдается в период лактации. Хотя степень окислительного стресса ОС у потомства уменьшается после прекращения приема пестицида или его метаболитов через грудное молоко, последствия воздействия фипронил- индуцированного ОС на развивающийся организм, нуждается в дальнейших исследованиях.

6

Литература

1. Abdollahi M. Pesticides and oxidative stress: a review. / M.Abdollahi, A.Ranjbar, S.Shadina, S.Nikfar, A.Rezaie // Medic. Sci. Monitor. -2004. -Vol. 10. -Р. 141-147.
2. Agarwal A. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. / A.Aponte- Mellado, B.J.Premkumar, A.Shaman, S.Gupta // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2012. -Vol. 10. -N1, -P. 10-49.
3. Ahmed O.M. Effects of experimentally induced maternal hypothyroidism and hyperthyroidism on the development of rat offspring: I. The development of the thyroid hormonesneurotransmitters and adenosinergic system interactions / S.M.Abd El-Tawab, R.G.Ahmed // Int. J. Dev. Neurosci. -2010.-Vol. 28. -P. 437-454.
4. Ahmed R.G. Perinatal TCDD exposure alters developmental neuroendocrine system. / R.G.Ahmed // Food Chem. Toxicol. -2011. -Vol. 49. -P. 1276-1284.
5. Al-Gubory K.H. The roles of cellular reactive oxygen species, oxidative stress and antioxidants in pregnancy outcomes. / P.A.Fowler, C.Garrel // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. -2010. -Vol. 42. -N.10. -P.1634-1650.
6. Amin K.A. Deltamethrin-induced oxidative stress and biochemical changes in tissues and blood of catfish (Clariasgariepinus): antioxidant defense and role of alpha-tocopherol / K.S.Hashem // BMC Veterinary Research. -2012. -Vol. 8. N.1. -P.8-45.
7. Clasen B. Effects of the commercial formulation containing fipronil on the non-target organism Cyprinuscarpio: Implications for rice-fish cultivation / V.L.Loro, R.Cattaneo, B.Moraes, T.Lopes, L.Antonio de Avila, R.Zanella, G.B.Reimche, B.Baldisserotto // Ecotoxicology and Environmental Safety. -2012. -Vol. 77. -P. 45-51.
8. Ferreira M. Action of the chemical agent fipronil (active ingredient of acaricide Frontline) on the liver of mice: An ultrastructural analysis / P.R.De Oliveira, S.E.Denardi, G.H.Bechara, M.I.Mathias // Microscopy Research and Technique. -2012. -Vol. 75. N. 2. -P. 197- 205.http://dx.doi.org/10.1002/jemt.21043
9. Gan J. Occurrence of Fipronil and Its Biologically Active Derivatives in Urban Residential Runoff / S.Bondarenko, L.Oki, D.Haver, J.X.Li // Environmental Science & Technology. -2012. -Vol. 46. -N. 3. -P. 1489-1495.
10. Hainzl D. Fipronil insecticide: Novel photochemical desulfinylation with retention of neurotoxicity // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1996. -Vol. 93. -N. 23. -P. 12764-12767.
11. Hainzl D. Mechanisms for Selective Toxicity of Fipronil Insecticide and Its Sulfone Metabolite and Desulfinyl Photoproduct / L.M.Cole, J.E.Casida // Chemical Research in Toxicology. -1998. -Vol. 11. N. 12. -P. 1529-1535.

7

1. KarimovKh.Y.a. Changes in some indices of the synthesis of nitric oxide during the early stages of hepatocarcinogenesis / F.K.h.Inoyatova, M.T. Mukhamedova // Experimental and Toxicologic Pathology. -2003. -Vol. 55. -N. 1. -P. 17-19.
2. Ki Y.W. Reactive oxygen species and mitogen-activated protein kinase induce apoptotic death of SH-SY5Y cells in response to fipronil / J.E.Lee, J.H.Park, In.C.Shin, H.C.Koh // Toxicology Letters. -2012. -Vol. 211. N. 1. -P. 18-28.
3. Lee J.E. Akt/GSK3e signaling is involved in fipronil-induced apoptotic cell death of human neuroblastoma SH-SY5Y cells / J.S.Kang, Y.W.Ki, S.H.Lee, S.J.Lee, K.S.Lee, H.C.Koh // Toxicology Letters. -2011.-Vol. 202. -N. 2. -P. 133-141.
4. Lee S.J. Acute illnesses associated with exposure to fipronil—surveillance data from 11 states in the United States, 2001-2007 / P.Mulay, B.Diebolt-Brown, M.J.Lackovic, L.N.Mehler, J.Beckman, J.Waltz, J.B.Prado, Y.A.Mitchell, Sh.A.Higgins, A.Schwartz, G.M.Calvert // Clinical Toxicology. -2010. -Vol. 48. -N. 7. -P. 737-744.
5. Lessiter T.L. Is fipronil safer than chlorpyrifos? Comparative developmental neurotoxicity modeled in PC12 cells / E.A.MacKillop, I.T. Ryde, F.J.Seidler, T.A. Slotkin // Brain Research Bulletin. -2009. -Vol. 78. -N. 6. -P. 313-322.
6. Mohamed F. Acute Human Self- Poisoning with theN- Phenylpyrazole Insecticide Fipronil-a GABAA- Gated Chloride Channel Blocker / L.Senarathna, A.Percy, M.Abeyewardene, G.Eaglesham, R.Cheng, Sh.Azher, A.Hittarage, W.Dissanayake, M.H.Rezvi Sheriff, W.Davies, N.A.Buckley, M.Eddleston // Clinical Toxicology. -2004. -Vol. 42. -N. 7. -P. 955-963.
7. Ohi M. Reproductive adverse effects of fipronil in Wistar rats // Toxicology Letters. -2004. -Vol. 146. -N. 2. -P. 121-127.
8. Schoeters G.E. Biomonitoring and biomarkers to unravel the risks from prenatal environmental exposures for later health outcomes / E.D.Hond, G.Koppen, R.Smolders, K.Bloemen, P.DeBoever, E.Govarts // American Journal of Clinical Nutrition. -2011. -Vol. 94. -N. 6. -P. 1964-1969.
9. Slotkin T.A. Oxidative stress from diverse developmental neurotoxicants: Antioxidants protect against lipid peroxidation without preventing cell loss / F.J. Seidler // Neurotoxicology and Teratology. -2010. -Vol. 32. -N. 2. -P. 124-131.
10. Stehr C.M. The Developmental Neurotoxicity of Fipronil: Notochord Degeneration and Locomotor Defects in Zebrafish Embryos and Larvae // Toxicological Sciences. -2006. -Vol. 92. -N. 1. -P. 270-278.
11. Tingle C.C. Fipronil: environmental fate, ecotoxicology, and human health concerns / J.A.Rother, C.F.Dewhurst, S.Lauer, W.J.King // Rev Environ ContamToxicol. -2003. -Vol. 176. -P. 1-66. Review.
12. Tuzmen N. Biochemical effects of chlorpyrifos and deltamethrin on altered antioxidative defense mechanisms and lipid peroxidation in rat liver / N.Candan, E.Kaya, N.Demiryas // Cell Biochemistry and Function. -2008. -Vol. 26. -N. 1. -P. 119-124.
13. Valko M. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease / D.Leibfritz, J.Moncol, M.T.Cronin, M.Mazur, J.Telser // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. -2007. -Vol. 39. -N. 1. -P. 44-84.