Определение мутагенной активности производных тиазола и бензотиазола

В статье представлены данные об изучении потенциальных лекарственных препаратов. Проведен ана­лиз 2-амино-4-фенилтиазола и 7-бром-2-аминобензотиазола на предмет обнаружения мутагенной ак­тивности с применением теста Эймса. Для выявления мутации замены пар оснований и сдвига рамки считывания использовались штаммы Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100. В ходе эксперимента не выявлено мутагенной активности исследуемых веществ при использовании обоих штаммов.

Появление новых химических соединений требует проведения исследований для определения свойств, с целью дальнейшего их использования в качестве фармацевтических препаратов. В связи с быстрыми темпами развития фармакологической науки во всем мире значительно увеличился инте­рес к органической химии как основному источнику биологически активных веществ. Значительный интерес представляет химия гетероциклических соединений. Это связано с целым рядом особых свойств, проявляющихся у подобных веществ. К данным свойствам можно отнести различные виды фунгицидной, акарицидной, фармакологической активности, новые оптические свойства получаемых органических соединений, возможность их применения во многих отраслях человеческой деятельно­сти. Изучение мутагенной активности вновь синтезированных химических соединений необходимо для возможного их применения в качестве лекарственных препаратов.

Для определения мутагенного действия новых веществ в настоящее время используются мето­ды, позволяющие определить возникновение генных и хромосомных мутаций. Тест, выявляющий наличие генных мутаций, разработан в лаборатории доктора Эймса. Он основан на определении ре-вертантных колоний штаммов S.typhimurium, ауксотрофных по гистидину, к прототрофности. В рабо­те использованы два штамма S.typhimurium ТА 98 и ТА 100, позволяющие определить мутации двух типов: замены пар оснований и сдвига рамки считывания. Тестирование с применением этих двух штаммов позволяет всесторонне анализировать возможное мутагенное действие исследуемых ве­ществ. В настоящее время в цитогенетических лабораториях также используется микроядерный тест, позволяющий без больших материальных и временных затрат определить хромосомные мутации в мазках крови лабораторных животных в качестве модельных объектов [1, 2].

С целью выявления возможного мутагенного влияния веществ, синтезированных учеными хи­мического факультета КарГУ имени Е.А.Букетова, использовали методики, позволяющие оценить мутагенную активность. На сегодняшний день известны экспресс-методы для определения генных и хромосомных мутаций. Эти методы позволяют в короткие сроки, без больших материальных и вре­менных затрат и в то же время с высокой степенью достоверности определить мутагенную актив­ность испытуемых веществ.

В лаборатории молекулярной генетики исследовательского парка биотехнологии и экомониторинга биолого-географического факультета КарГУ имени Е.А.Букетова имеются штаммы Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100. Штаммы приобретены из Республиканской коллекции микроорганиз­мов. Из-за специально вызванных мутаций в гистидиновом опероне эти штаммы являются ауксотро-фами по гистидину. Но под влиянием мутагена происходит реверсия к прототрофности, и штаммы обретают способность синтезировать гистидин. Использованные в настоящей работе культуры харак­теризуются наличием плазмиды рКМ 101, которая увеличивает вклад ошибочной репарации ДНК в общий процесс восстановления после мутагенного воздействия, тем самым значительно повышает чувствительность метода. Кроме того, эта плазмида придает штаммам устойчивость к ампициллину, что облегчает их хранение на чашках с питательными средами. Причем штамм ТА 98 ревертирует к прототрофности путем сдвига рамки считывания, а штамм ТА 100 — путем замены пар основа­ний [3].

В ходе эксперимента тестировали производные тиазола и бензотиазола, а именно 2-амино-4-фенилтиазола и 7-бром-2 аминобензотиазола. Следуя рекомендациям методики, вещества испытывали в концентрациях 0,1000 мг/мл, 0,0100 мг/мл, 0,0010 мг/мл. В качестве позитивного контроля исполь­зовали циклофосфан (500 мг/чашку) для штамма ТА 100 и бромистый этидий (10 мг/мл) для штамма ТА 98. В качестве негативного контроля применяли стерильную дистиллированную воду, а также диметилсульфоксид, который являлся растворителем исследуемых соединений.

Для проведения эксперимента первоначально определяли соответствие штаммов генотипам. Для этого высевали их на чашки Петри с эндо агаром, способствующим росту микроорганизмов группы энтеробактерий, к которым относятся и штаммы Salmonella typhimurium. В среду добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Для определения ауксотрофности по гистидину выращивали ночную культуру, высевали на чашки Петри с минимальной средой с целью получения газона бакте­риальной культуры. Затем наносили гистидин и стерильную воду на стерильный диск фильтроваль­ной бумаги, помещенный в середину чашки [4].

После определения генотипов штаммов Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100 проводили ис­следования на определение генных мутаций испытуемых веществ.

С каждым штаммом проводили эксперимент по 10 раз. Каждый раз определяли титр бактери­альной культуры. Для этого ночную культуру подращивали в 100 мл питательной среды (мясопеп-тонном бульоне) при непрерывном покачивании в шейкере. Для определения титра культуры прово­дили серию десятикратных разведений в стерильной дистиллированной воде. Затем шпателировани-ем высевали культуру на чашки со средой эндо с 6 и 7 разведениями. Выращивали штаммы в термо­стате при температуре 37 °С в течение 18-24 часов. Затем подсчитывали количество выросших коло­ний на чашках с соответствующим разведением культуры. Титр культуры Salmonella typhimurium ТА 98 составлял 2,2-2,7^10⁹, Salmonella typhimurium ТА 100 — 2,5-3,1^10⁹.

Фотография одного из экспериментов представлена на рисунке.

Рисунок демонстрирует количество колоний, выросших после серий десятикратных разведений. Процедура необходима для определения титра бактериальной культуры с целью анализа данных, по­лученных в результате эксперимента.

Большое количество бактериальных клеток, составляющее в наших экспериментах 10⁹, необхо­димо для определения возможной мутагенной активности тестируемых веществ. Учитывая, что спон­танные мутации возникают с частотой 1 на 10⁶-10⁷ клеток, нам удалось вырастить индикаторные штаммы до нужной степени.

С полученной суспензией штаммов Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100 проводили после­дующие манипуляции. Для этого вносили в пробирки с верхним полужидким агаром последователь­но тестируемое вещество, биотин, гистидин и один из используемых штаммов. Чтобы не застыл агар и в то же время не погибла культура микроорганизмов, поддерживали температуру среды 45 °С. По­сле наслоения верхнего агара на нижний минимальный 1,5 %-ный агар чашки подсушивали в течение 30-40 минут, ставили в термостат на 37 °С. Количество колоний-ревертантов подсчитывали через 48 часов.

В экспериментах со штаммами Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100 использовали по 3 чашки для каждой концентрации тестируемого вещества.

Для оценки степени мутагенности использовали шкалу, предложенную Эймсом, Фонштейном. Согласно ей возможны результаты, приведенные ниже:

1. Количество колоний на опытных и контрольных чашках различается более чем в 2,5 раза. Следовательно, в данном эксперименте мутагенной активности не выявлено, проставляли индекс му­тагенности (-).
2. Число колоний на опытных чашках превышает контрольное в 2,5-10 раз. Выявлена слабая степень мутагенной активности. Индекс мутагенности (+).
3. Число ревертантных колоний на опытных чашках на один — два порядка превышает кон­трольное. Выявлена средняя степень мутагенной активности. Индекс мутагенности (++).
4. Число колоний на опытных чашках более чем в 100 раз превышает показатель числа колоний на чашках с чистым контролем. Выявлена сильная степень мутагенной активности. Индекс мутаген­ности (+++). [5]

Результаты анализа мутагенной активности 2-амино-4-фенилтиазола приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, количество колоний-ревертантов на чашках с 2-амино-4-фенилтиазолом соизмеримо с уровнем бактерий на среде с добавлением отрицательных контрольных образцов: сте­рильной воды и диметилсульфоксида. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии мута­генной активности испытуемого соединения. Не обнаружено увеличения количества ревертантных колоний Salmonella typhimurium ни в случае со штаммом ТА 98, ни при использовании штамма ТА 100. Следовательно, амино-4-фенилтиазол не вызывает генных мутаций ни с заменой пар основа­ний, ни со сдвигом рамки считывания.

С целью определения мутагенной активности 7-бром-2-аминобензотиазола проводили исследо­вания, аналогичные описанным выше при тестировании 2-амино-4-фенилтиазола. Определяли мута­ции замены пар оснований и сдвига рамки считывания. Выращивали культуры штаммов Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100 до плотности 10⁶-10⁷. Освежали их, помещая в колбы с мясопептонным бульоном и продолжали выращивать при температуре 37 °С с покачиванием. После центрифугирова­ния и промывания в фосфатном буфере ресуспендировали клетки, доводя плотность культуры до 10⁹. Для определения титра бактериальных культур Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100 проводили серию десятикратных разведений в стерильной воде. С целью определения титра бактериальной культуры высевали на чашки с 6 и 7 разведениями. Количество бактериальных клеток в 1 мл в сред­нем составляло: для штамма Salmonella typhimurium ТА 98 — 10⁹, для штамма Salmonella typhimurium ТА 100 — 10⁹.

Как и в случае с тестированием 2-амино-4-фенилтиазола, в экспериментах со штаммами Salmo­nella typhimurium ТА 98 и ТА 100 использовали по 3 чашки для каждой концентрации тестируемого вещества. Каждый эксперимент выполняли в десяти повторностях. Подсчитывали количество коло­ний с обратными мутациями от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Средние данные по количеству колоний-ревертантов, выросших при тестировании 7-бром-2-аминобензотиазола, поло­жительных и отрицательных контрольных образцов, представлены в таблице 2.

Данные таблицы 2 демонстрируют отсутствие мутагенной активности 7-бром-2-аминобензо-тиазола, поскольку количество ревертантных колоний, выросших на минимальной среде при добав­лении тестируемого вещества, а также отрицательных контрольных образцов стерильной воды и ди-метилсульфоксида оказалось приблизительно одинаковым при использовании обоих штаммов — как Salmonella typhimurium ТА 98, так и Salmonella typhimurium ТА 100. Этот факт доказывает, что 7-бром-2-аминобензотиазол не вызывает ни мутации типа сдвига рамки считывания, ни замены пар оснований.

В среднем титр бактериальной культуры составил у штамма Salmonella typhimurium ТА 98 — 2,2х10⁹. В 6-м разведении — от 118 колоний до 270, в 7-м — от 13 до 36 колоний. Для штамма Sal­monella typhimurium ТА 100 — 2,7х10⁹. В 6-м разведении — от 170 колоний до 310, в 7-м — от 26 до 35 колоний.

Дальнейшие исследования предполагают расширение спектра тестируемых соединений с потен­циальной фармацевтической активностью, а также продолжение тестирования 2-амино-4-фенил-тиазола и 7-бром-2-аминобензотиазола в микробиологоческом тесте Эймса с метаболической актива­цией in vivo in vitro. 

Список литературы

1. Харбиев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.М.: Медицина, 2005.— 832 с.
2. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий) / А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин. — М.: Меди­цина, 1998. — 328 с.
3. Оценка мутагенности новых лекарственных средств: Метод. рекомендации. — М., 1994. — 20 с.
4. Bahrami K., Khodae M.M., Naali F. Mild and Highly Efficient Method for the Synthesis of 2-Arylbenzimidazoles and 2-Arylbenzothiazoles // J. Org. Chem. — 2008. — 73. — P. 6835-6837.
5. Гуськова Т.Д. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения // Хим.-фарм. журн.— № 7. — С. 10-15.