Функциональное состояние клеток врожденного иммунитета у пациентов с синдромом диабетической стопы

В статье приведены данные обследования 14 пациентов, страдающих сахарным диабетом 2 типа с синдромом диабетической стопы, и 22 человека из группы сравнения. Отмечено, что у больных с синдромом диабетической стопы в 9,1 раза снижено процентное содержание нейтрофилов, способ­ных формировать внеклеточные ловушки в цельной крови, и на 9,6 % уменьшено количество моноци­тов, формирующих внеклеточные ловушки. Показано также, что при наличии синдрома диабетиче­ской стопы у моноцитов снижена способность к выработке активных форм кислорода (по результатам НСТ-теста), при сохраненной функции поглощения чужеродных объектов. Определено, что нейтрофилы больных с синдромом диабетической стопы демонстрировали активацию фагоцитоза (фагоци­тарное число увеличивалось на 40,8 %), но обладали уменьшенной выраженностью реакции на внеш­ние стимулы. Таким образом авторами установлено, что синдром диабетической стопы определяет развитие дисбаланса в системе врожденного иммунитета. 

Сахарный диабет в настоящее время представляет собой одну из самых актуальных проблем ме­дицины. Это связано, в первую очередь, с широким распространением этой патологии. В последние 30 лет заболеваемость сахарным диабетом неуклонно повышается. Количество больных сахарным диабетом удваивается каждые 10-15 лет. В 2000 г. во всем мире страдало сахарным диабетом около 171 миллиона человек, в 2006 г. — 246 миллионов. По прогнозу на 2030 г. число больных этим забо­леванием составит примерно 366 миллионов. При этом более 80 % случаев составляет сахарный диа­бет типа 2. Обращает на себя внимание тот факт, что прирост наиболее выражен среди лиц старше 65 лет. Это, скорее всего, связано с широкой распространенностью и преобладанием сахарного диа­бета 2 типа [1]. По оценке ВОЗ число больных сахарным диабетом в 2011 г. составило в Российской Федерации 3,357 млн. человек [2]. При сахарном диабете страдают все виды обмена веществ, нару­шаются функции не только эндокринной, но и сердечно-сосудистой и нервной систем. При недоста­точном контроле уровня сахара в крови формируются различные осложнения, что является причиной развития инвалидности и часто приводит к ранней смерти пациентов.

Сахарный диабет неблагоприятно воздействует и на иммунную систему. Отмечается нарушение функций нейтрофилов, связанное, по мнению авторов, с плохим контролем гликемии [3]. При инку­бации нейтрофилов в среде с высоким уровнем глюкозы уменьшалась способность к формированию активных форм кислорода [4]. У больных сахарным диабетом с тяжелыми осложнениями возрастала способность моноцитов реагировать выработкой активных форм кислорода на действие чужеродных агентов, что отразилось в статистически значимом увеличении функционального резерва моноцитов. Нейтрофилы таких пациентов обладали повышенной способностью к фагоцитозу [5]. Интенсивность фагоцитоза у пациентов с сахарным диабетом 2 типа положительно коррелировала с уровнем глюко­зы в крови и содержанием гликированного гемоглобина. Уровень триглицеридов отрицательно свя­зан с интенсивностью индуцированного НСТ-теста моноцитов и процентным содержанием внекле­точных нейтрофильных ловушек [6].

Цель настоящей работы — оценка состояния функциональной активности нейтрофилов и моно­цитов у больных сахарным диабетом 2 типа с синдромом диабетической стопы.

Материалы и методы

При проведении работы обследованы 14 больных сахарным диабетом 2 типа с синдромом диа­бетической стопы и 22 человека из группы сравнения. Критерии включения в основную группу: са­харный диабет 2 типа со стажем болезни не менее 1 года, согласие на участие в исследовании. Крите­рии исключения: злокачественные новообразования любой локализации, цирроз печени, психические заболевания, острые инфекции, травмы или оперативные вмешательства в течение последних 6 меся­цев, использование больными иммуномодуляторов и вакцин в течение последних 6 месяцев. По­скольку пациенты с сахарным диабетом также страдали артериальной гипертензией и/или ишемиче-ской болезнью сердца, в группу сравнения были включены пациенты с этими нозологиями, которые имели нормальный уровень глюкозы крови. Обследование проводилось на вторые сутки после по­ступления. Возраст больных составил 60,57 ± 2,29 года в основной группе и 61,68 ± 2,83 года — в группе сравнения. У обследуемых людей исследовали функциональную активность нейтрофилов и моноцитов: количество клеток, способность к фагоцитозу частиц латекса, уровень выработки актив­ных форм кислорода по НСТ-тесту (спонтанному и стимулированному), лизосомальную активность. В выделенных чистых фракциях моноцитов и нейтрофилов определяли способность клеток к форми­рованию внеклеточных ловушек. Этот показатель исследовали в спонтанном варианте и после сти­муляции пирогеналом [7]. По методу, описанному в [8], оценивали способность эффекторов врож­денного иммунитета к адгезии по относительной доле фиксированных клеток (активность адгезии) и размерам клеток, которые определяли с помощью окуляр-микрометра. Статистический анализ прово­дили с помощью пакета прикладных статистических программ SPSS. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (М+m). Для оценки статистической значимости различий между группами использовали непараметрические критерии Манна-Уитни (U), Колмогоро­ва-Смирнова (KS) и Вальда-Вольфовица (WW). При сравнении связанных переменных применяли парный критерий Вилкоксона (PKW). Различия считали статистически значимыми прир < 0,05 [9].

Результаты и обсуждение

Содержание глюкозы в сыворотке крови составило 4,42 ± 0,10 мМ/л в группе сравнения и 12,00 ± 0,79 мМ/л — у пациентов с сахарным диабетом (р = 0,001, KS). Это указывает на нормальный углеводный обмен у лиц из группы сравнения и недостаточно эффективный контроль гликемии у людей, страдающих синдромом диабетической стопы. Индекс массы тела был равен 26,84 ± 1,09 кг/м2 в группе сравнения и 28,79 ± 2,39 кг/м2 у больных с синдромом диабетической стопы. Различия были статистически значимыми (р = 0,001 U). Данные указывают на наличие избыточной массы тела в стадии предожирения у лиц из обеих групп.

Количество нейтрофилов в крови демонстрировало тенденцию к увеличению и составило 7,11 ± 0,54><10⁹/л в группе сравнения и 8,40 ± 0,80 в группе пациентов с диабетической стопой. Нали­чие синдрома диабетической стопы сопровождалось увеличением уровня палочкоядерных нейтрофи-лов до 5,25 ± 1,37 % (в группе сравнения 2,73 ± 0,91 %, р = 0,04, U). При этом содержание лимфоци­тов статистически значимо снижалось с 16,91 ± 1,10 % в группе сравнения до 12,0 ± 1,20 % (р = 0,016, U). Наличие элементов сдвига лейкоцитарной формулы влево, при отсутствии статистически значи­мого лейкоцитоза, можно рассматривать как свидетельство наличия воспалительного очага при син­дроме диабетической стопы.

При изучении состояния нейтрофилов в цельной крови было установлено, что 2,65 ± 1,36 % ней-трофилов лиц из группы сравнения формировали внеклеточные ловушки. Наличие синдрома диабе­тической стопы вызывает статистически значимое снижение этого показателя до 0,29 ± 0,13 % (р = 0,037, U). Стимуляция клеток пирогеналом вызывала разнонаправленную реакцию: в группе сравнения показатель демонстрировал только тенденцию к уменьшению и составил 2,10 ± 0,91 %. Под действием пирогенала возросла функциональная активность и 0,57 ± 0,20 % нейтрофилов боль­ных сахарным диабетом образовывали внеклеточные ловушки, различия со спонтанным уровнем ока­зались статистически значимыми (р = 0,046, PKW). При этом, несмотря на выраженную разницу уровня клеток, формирующих внеклеточные ловушки после стимуляции, статистической значимости они не достигли. Внеклеточные ловушки формируются эффекторными клетками врожденного имму­нитета за счет выброса за пределы цитоплазматической мембраны петель из собственной ДНК. Ло­вушки обеспечивают фиксацию микроорганизмов, высокоэффективный киллинг и разрушение чуже­родных агентов за счет высокой концентрации бактерицидных субстанций. Наши данные свидетель­ствуют, что нейтрофилы больных с синдромом диабетической стопы сохраняют способность поло­жительно реагировать на дополнительную стимуляцию, но при этом относительное количество обра­зованных внеклеточных ловушек меньше, чем в группе сравнения.

Как видно на рисунке, нейтрофилы больных сахарным диабетом с синдромом диабетической стопы в чистой фракции формировали меньше внеклеточных ловушек, чем клетки лиц из группы сравнения. Однако эти различия не достигли статистической значимости. Относительная доля моно­цитов, продуцировавших внеклеточные ловушки, при синдроме диабетической стопы была значимо меньше — в 1,86 раза (р = 0,040, U). После стимуляции пирогеналом сохранилась только тенденция к уменьшению способности формировать внеклеточные ловушки.

Рисунок. Количество клеток (%), формирующих внеклеточные ловушки в чистой фракции

Обращает на себя внимание тот факт, что в обеих группах отмечалась позитивная реакция на стимуляцию пирогеналом, и доля клеток, формировавших внеклеточные ловушки, повышалась ста­тистически значимо как для нейтрофилов, так и для моноцитов. Однако степень прироста в группе сравнения составила 2,32 для нейтрофилов и 1,99 для моноцитов. Аналогичный показатель для боль­ных с синдромом диабетической стопы составил 3,57 и 2,56 соответственно. Таким образом, синдром диабетической стопы обусловливает тенденцию к увеличению реактивности клеток на дополнитель­ную стимуляцию.

Как видно из таблицы, способность моноцитов к поглощению чужеродных частиц в обеих изу­чаемых группах практически не различалась. Способность моноцитов к выработке активных форм кислорода статистически значимо возрастала у пациентов с синдромом диабетической стопы. Актив­ность спонтанного НСТ-теста была выше при наличии диабетической стопы в 1,48 раза, а интенсив­ность спонтанного НСТ-теста была выше, чем в группе сравнения в 1,65 раза. После инкубации кле­ток с частицами латекса в качестве дополнительной стимуляции наблюдаемая картина не измени­лась: активность и интенсивность индуцированного НСТ-теста также статистически значимо выше в группе пациентов с синдромом диабетической стопы в 1,89 и 1,81 раза соответственно.

Дополнительно был рассчитан функциональный резерв как соотношение активности или интен­сивности индуцированного и спонтанного вариантов НСТ-теста. Функциональный резерв моноцитов был статистически значимо выше в группе пациентов с синдромом диабетической стопы, что указывает на повышенную способность моноцитов активироваться под действием дополнительного стимула.

При оценке состояния нейтрофилов было обнаружено, что фагоцитарное число статистически значимо выше у лиц с синдромом диабетической стопы относительно группы сравнения в 1,47 раза (табл.). Показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста демонстрировали тенденцию к сни­жению в группе пациентов с сахарным диабетом. При этом функциональный резерв нейтрофилов, рассчитанный по интенсивности, статистически значимо снизился и составил 81,6 % относительно группы сравнения. Результаты указывают на снижение способности нейтрофилов увеличивать выра­ботку активных форм кислорода при дополнительной стимуляции.

Выводы

1. Синдром диабетической стопы сопровождается ингибированием способности нейтрофилов и моноцитов формировать внеклеточные ловушки в цельной крови и чистой фракции клеток.
2. Моноциты больных с синдромом диабетической стопы характеризуются сохраненной способ­ностью к фагоцитозу и увеличенной выработкой активных форм кислорода как в спонтанном вариан­те НСТ-теста, так и при дополнительной стимуляции частицами латекса.
3. У нейтрофилов пациентов с синдромом диабетической стопы увеличена способность к фаго­цитозу и снижена выработка активных форм кислорода при стимуляции частицами латекса.
4. Синдром диабетической стопы у больных сахарным диабетом определяет формирование дис­баланса в состоянии эффекторных клеток системы врожденного иммунитета. 

Список литературы

1. Wild S., Roglic G., Green A., Sicree R., King H. Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030 // Diabetes Care. — 2004. — 27. — P. 1047-1053.
2. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. — М., — 115 с.
3. Gallacher S.J., Thomson G., Fraser W.D. et al. Neutrophil bactericidal function in diabetes-mellitus — evidence for associa­tion with blood-glucose control // Diabetic Medicine. — 1995. — 12, Iss. 10. — P. 916-920.
4. Nielson C.P., Hindson D.A. Inhibition of polymorphonuclear leukocyte respiratory burst by elevated glucose concentrations in vitro // Diabetes. — 1989. — 38, No. 8. — P. 1031-1035.
5. Тарабрина Ю.О., Колесников О.Л., Колесникова А.А., Абрамовских О.С. Оценка показателей липидного обмена и функционального состояния иммунной системы у больных сахарным диабетом 2 типа в зависимости от выраженности поздних осложнений // Вестн. Челябинского гос. ун-та. — 2013. — № 7 (298). Биология. — Вып. 2. — С. 204-205.
6. Долгушин И.И., Тарабрина Ю.О., Колесников О.Л. и др. Оценка взаимосвязей между показателями углеводного и ли-пидного обмена и активностью иммунной системы у больных сахарным диабетом 2 типа // Вестн. Уральской мед. академич. науки. — — № 2 (39). — С. 31-32.
7. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального стату­са нейтрофилов. — М.: РАМН, 2009. — 208 с.
8. Зурочка А.В. Иммунобиологические свойства секреторных продуктов нейтрофилов (нейтрофилокинов): Дис. ... д-ра мед. наук. — Челябинск, 1991. — 231 с.
9. НаследовА.Д.SPSS 15: профессиональный статистический анализ данных. — СПб.: Питер, 2008. — 416 с.