Оценка степени экологической общности микроорганизмов, выделенных из ожоговых ран

В статье с использованием методов микробной экологии (индексы сходства Жаккара и Раупа-Крика, анализ главных координат) выявлены ассоциации микроорганизмов в ожоговых ранах. Показано, что устойчивые ассоциации могут сформироваться в результате антибиотикотерапии и антагонистических взаимоотношений между экологическими группами микроорганизмов. Представлены эксперимен­тальные данные, дано их обсуждение. 

Воздействие высокой температуры при ожогах пламенем и при контакте с термическим агентом способно «стерилизовать» рану. По мере пребывания больного в стационаре ожоговая рана контами-нируется микрофлорой, при этом скорость заселения зависит от многих факторов: места получения травмы, способа оказания первой помощи, локализации ожога, наличия госпитальных возбудителей и т.д. [1].

По результатам исследований, проведённых нами ранее, приоритетными микроорганизмами, выделяющимися из ран пациентов Челябинского областного ожогового центра, являлись S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii [2]. Высокая этиологическая значимость данных микроорганизмов отме­чается и в работах других исследователей, что позволяет считать их основными возбудителями ожо­говой инфекции [3-5]. При этом основные возбудители часто встречаются в ассоциациях с различными условно-патогенными микроорганизмами: E. coli, Proteus sp., Klebsiella sp. и др. [6-8]. Закономерности формирования подобных ассоциаций остаются недостаточно изученными. Вместе с тем выявление причин экологической общности разных микроорганизмов в ожоговых ранах важно для каждого стационара, так как позволяет определить стратегию антибиотикотерапии и противоэпи-демиологического режима. Поэтому цель данной работы заключалась в выявлении устойчивых ассо­циаций микроорганизмов в ожоговых ранах и объяснении возможных причин их экологической общ­ности.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе бактериологической лаборатории МБУЗ ГКБ № 6 г. Челя­бинска. Были проанализированы результаты бактериологических посевов пациентов, госпитали­зированных в Челябинский областной ожоговый центр с января по июнь 2012 г. Всего исследована 341 проба раневого отделяемого.

Для выявления ассоциаций микроорганизмов в ходе статистического анализа использовали рас­чёт индексов сходства Жаккара C_j и Раупа-Крика C_R-C, а для интерпретации ассоциаций полученные матрицы индексов сходства подвергали многомерной ординации методом главных координат. Оцен­ку статистической значимости для C_j проводили с использованием таблиц критических значений [9], а для CR-C рассчитывали как P = 1 - CR-C.

Статистически значимыми признавали ассоциации микроорганизмов при P < 0,05, незначимы­ми — при P > 0,10; в промежуточных случаях (0,05 < P < 0,10) обсуждали тенденции к ассоциациям. Расчёты и графические построения выполнены в пакете PAST (v. 2.17c) [10].

Результаты и обсуждение

Из 341 пробы в 104 (30,5 %) посев раневого отделяемого не дал роста, т.е. высеваемость микро­флоры составила 69,5 % (n = 237). В 176 пробах (51,6 %) возбудитель был представлен монокульту­рой. В 61 пробе (17,9 %) были выделены ассоциации из 2 и более микроорганизмов, из них 29 проб (48,3 %) содержали смешанные популяции приоритетных микроорганизмов: S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii.

В результате анализа 61 пробы с ассоциациями были рассчитаны показатели экологической общности, которые представлены в таблице.

Коэффициент Жаккара C_j, наряду с коэффициентом Дайса (Сёренсена, Чекановского-Сёренсе-на), является одной из наиболее распространённых парных мер сходства в фаунистических, флори­стических, экологических исследованиях и применяется также в микробной экологии [11]. В контек­сте данной работы он представляет собой отношение числа проб, содержащих одновременно два микроорганизма, к числу проб, содержащих хотя бы один из этих двух микроорганизмов. Таким об­разом, C_j = 0 указывает на отсутствие совместной встречаемости организмов, а C_j = 1 — на исключи­тельно совместную встречаемость двух организмов. С помощью данного коэффициента удалось вы­явить только одну статистически значимую ассоциацию: S. aureus и P. aeruginosa (C_j = 0,57; P = 0,001).

Коэффициент Раупа-Крика C_R-C является вероятностной мерой сходства. Он рассчитывается с использованием рандомизационной процедуры Монте-Карло на основе сравнения наблюдаемого числа случаев совместного присутствия организмов в пробе с распределением их совместной встре­чаемости в 1000 случайным образом сгенерированных выборках из данных по обоим видам. По­скольку C_R-C представляет собой вероятность неслучайной ассоциации организмов, оценку статисти­ческой значимости для него можно вычислить как P = 1-CR-C. С помощью данного коэффициента удалось выявить 2 статистически значимые ассоциации: Proteus sp. и Citrobacter freundii (CR-C = 0,99; P = 0,008) и S. aureus и P. aeruginosa (C_R-C = 0,95; P = 0,048). Также была обнаружена тенденция к ас­социациям следующих микроорганизмов: C. albicans и Proteus sp. (CR-C = 0,93; P = 0,069), C. albicans и Citrobacter freundii (C_R-C = 0,92; P = 0,080), Enterococcus faecalis и E. coli (C_R-C = 0,91; P = 0,092), Pseudomonas fluorescens и Candida tropicalis (CR-C = 0,90; P = 0,098).

Для визуализации обнаруженных ассоциаций и объяснения возможных причин экологической общности микроорганизмов, относящихся к разным таксонам, использовали многомерный анализ.

Анализ главных координат (многомерное метрическое шкалирование) представляет собой одну из техник непрямого градиентного анализа в экологии [12], родственную анализу главных компонент. Если в качестве меры сходства между показателями используется корреляция Пирсона, то результаты анализа главных координат будут аналогичны методу главных компонент. Однако в анализе главных координат можно использовать и другие меры сходства (в нашем случае — индексы Жаккара, Раупа-Крика и др.), тогда как выделенные в его результате оси (главные координаты, ГК) интерпретируются аналогично главным компонентам.

В ходе анализа главных координат было установлено, что данные слабо подвергались обобще­нию: даже на первую главную координату (ГК 1) приходилось только 13,5 % общей изменчивости совместного распределения микроорганизмов. Это указывает на существование большого числа фак­торов, специфически влияющих на микробный пейзаж.

На рисунке таксоны микроорганизмов представлены в пространстве двух первых координат, выделенных с использованием индекса сходства Жаккара (результаты с использованием индекса Раупа-Крика аналогичны и не приводятся). Объекты, находящиеся по разные стороны от нулевого значения, обнаруживают отрицательную связь, по одну сторону — положительную. Из рисунка вид­но, что все исследованные таксоны микроорганизмов распределились на 4 основных группы, для ко­торых были характерны высокие коэффициенты экологической общности (обведены пунктиром). В группу I вошли представители кишечной микрофлоры, в группу II — приоритетные возбудители ожоговой инфекции, III — представители кожной микрофлоры, IV — предположительно, госпиталь­ная флора фекального происхождения.

Вдоль ГК 1 проявилась отрицательная связь группы I со всеми остальными. Вошедшие в неё Proteus sp. и Citrobacter freundii являются представителями кишечной микрофлоры, которая заселяет поверхность ожоговых ран в первые дни после ожога [1]. Таким образом, ГК 1, вероятно, отражает временную динамику смены микробного пейзажа, когда первичные контаминанты раны замещаются на госпитальную микрофлору. Следовательно, выявленная устойчивая ассоциация Proteus sp. и Citrobacter freundii может маркировать пробы, собранные на ранних сроках госпитализации.

Вдоль ГК 2 отчётливо разделились группы, включающие представителей кожной микрофло­ры (III), госпитальной микрофлоры фекального происхождения (IV) и приоритетных возбудителей ожоговой инфекции (II). Полагаем, что ГК 2 отражает смену микробного пейзажа в процессе анти-биотикотерапии. Действительно, стандартная схема ведения ожоговых больных предполагает ис­пользование Р-лактамных антибиотиков в качестве стартовой терапии. Эти антибиотики эффективно подавляют в первую очередь кожную микрофлору (группа III), но остаются неэффективными в от­ношении микроорганизмов группы IV [13]. Поэтому на следующем этапе лечения пациентам назна­чают карбапенемы, которые ингибируют рост представителей группы IV. В результате такого лече­ния в ожоговой ране создаётся оптимальная среда для размножения устойчивых к Р-лактамам и кар-бапенемам микроорганизмов, сформировавших группу II. Таким образом, логичное объяснение по­лучает устойчивая ассоциация Enterococcus faecalis и E. шһ. Её представителей объединяет рези­стентность к Р-лактамам: для E. faecalis характерна природная устойчивость к антибиотикам, обу­словленная наличием хромосомной кассеты генов полирезистентности, а для E. — приобретён­ная, обусловленная наличием Р-лактамаз расширенного спектра. Наиболее сильная и высоко стати­стически значимая ассоциация S. aureus и P. аeruginosa также формируется в результате антибиоти-котерапии, оставляющей в ране полирезистентные штаммы указанных бактерий. Это объясняет вы­сокий процент высеваемости именно этих видов микроорганизмов на протяжении ряда лет [14]. Ин­тересной особенностью является близость Candida albicans к экологической группе II. Этот факт можно объяснить тем, что при использовании системной антибактериальной терапии грибы занима­ют освободившуюся от бактерий экологическую нишу.

Не исключено, что взаимоотношения между выделенными группами микроорганизмов опреде­ляются не только антибиотикотерапией, но и являются результатом антагонизма. Так и у S. aureus, и у P. аeruginosa установлена способность продуцировать бактериоцины, ингибирующие рост предста­вителей кишечной и кожной микрофлоры. В свою очередь для E. шһ, K. pneumoniae и C. freundii также характерна способность к бактериоциногении. Считается, что выход бактериоцинов зависит, прежде всего, от показателей плотности культуры-продуцента и далее регулируется собственной сигнальной системой — чувством кворума (quorum-sensing systems, Qs). Чувство кворума позволяет популяциям бактерий коллективно регулировать экспрессию генов и синхронизировать поведение группы, являясь своего рода «нейронной» сетью бактерий [15]. Таким образом, нерациональная ан-тибиотикотерапия может привести к избыточному размножению антибиотикорезистентных штам­мов, которые не только способны вызвать инфекцию, но и за счет массовой секреции бактериоцинов подавить рост популяции других бактерий, занимающих эту же экологическую нишу.

Выводы

1. С использованием методов микробной экологии в ожоговых ранах выявлены устойчивые ас­социации микроорганизмов, причем на долю популяции приоритетных микроорганизмов(S.aureus, P. aeruginosaиA. baumannii)приходилось 48,3 % от всех ассоциаций.
2. Представители разных экологических общностей редко обнаруживались совместно, что может быть следствием антимикробной терапии и/или свидетельством антагонистического характера взаи­моотношений между исследованными группами бактерий.

Список литературы

1. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Яковлев В.П. Ожоговая инфекция. Этиология, патогенез, диагностика, профилактика и лечение. — М.: Вузовская книга, 2010. — 416 с.
2. Андреева С.В., Бахарева Л.И., Нохрин Д.Ю. Видовой состав микрофлоры ожоговых ран // Вестн. Челябинского гос. ун-та. — 2013. — № 7 (298), Биология, Вып. 2. — С. 58-59.
3. Keen E.F. Incidence and bacteriology of burn infections at a military burn center // Burns. — 2010. — 36. — P. 461­468.
4. Kiuru V., Anttila V., Vuola J. Eradication of Acinetobacter baumannii Outbreak at a Burn Centre // Supplement to Journal of Burn Care and Research. — 2012. — 33, No. 2. — P. 15.
5. WongТ.Н., Tan B.H., Ling M.T., SongС.Multiresistant Acinetobacter baumanii on a burns unit — clinical risk factors and prognosis // Burns. — 2002. — 28, No. 4. — P. 340-349.
6. Шамаева С.Х., Миронов С.Х., Потепов А.Ф., Петрова К.М., Евграфов С.Ю. Микрофлора ожоговых ран и её чувст­вительность к антибиотикам у детей с ожоговой болезнью // Человек и его здоровье: Курский науч.-практ. вестн. — 2011. — № 2. — С. 91-95.
7. Iman A. Hussien, Khalid A. Habib, Kifah A. Jassim. Bacterial Colonization of Burn Wounds // J. Baghdad for Sci. — — No. 4. — P. 623-631.
8. Nagoba B.S., Deshmukh S.R., Wadher B.J., Pathan A.B. Bacteriological analysis of burn Sepsis // Indian J. Med. Sci. — 1999. — 53, No. 5. — P. 216-219.
9. Real R. Tables of Significant Values of Jaccard's Index of Similarity // Miscellania Zoologica. — 1999. — 22, No. 1. —29-40.
10. HammerО., Harper D.A.T., Ryan P.D. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis // Palaeontologia Electronica. — 2001. — 4, No. 1. — P. 9.
11. Ramette A. Multivariate analyses in microbial ecology // FEMS Microbiol. Ecol. — 2007. — 62, No. 2. — P. 142-160.
12. Tegendre P., Tegendre T. Numerical Ecology. — Amsterdam: Elsevier Science BV, — 853 p.
13. Андреева С.В., Бахарева Л.И., Шафикова Н.Э., Попова М.А., Угнивенко М.И. Особенности антибиотикочувствитель-ности этиологически значимой микрофлоры пациентов ожоговой реанимации / ТезисыXI междунар. конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии. — 2009. — Т. 11, № 4. — С. 9-10.
14. Андреева С.В., Бахарева Л.И., Валеева Д.М. Динамика антибиотикорезистентности у ведущих возбудителей ожого­вых инфекций // Вестн. Челябинского гос. ун-та. — 2013. — № 7(298), Биология, Вып. 2. — С. 60-61.
15. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Бактериоцины: их биологическая роль и тенденции применения // Исследовано в России: Электронный науч. журн. — С. 164-198. —URL: http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2011/016.pdf