Уточнение видовой принадлежности некоторых видов щелкунов (Coleoptera: Elateridae) на основе молекулярно-генетического анализа

В статье приведены сведения об апробации современных методов и уточнений видовой принадлежности почвообитающих личинок щелкунов (проволочников) на основе молекулярно-генетического анализа (ДНК-баркодирования). Впервые получены данные по полной идентичности определенных ДНК- последовательностей ряда видов щелкунов (Coleoptera: Elateridae), обитающих на территории Костанайской области (Казахстан), — опасных вредителей сельскохозяйственных культур. В то же время в мировом генетическом банке (GenBank) не обнаружены идентичные ДНК-последовательности расшифрованных нуклеотидных последовательностей ДНК для ряда изученных экземпляров. Основой для настоящего исследования послужили материалы, собранные в 2018 г. в подзоне обыкновенных черноземов на супесчаных почвах (Мендыкаринский район). Отбор личинок проводился методом стандартных почвенно-зоологических проб. Фиксация и хранение отобранных личинок щелкунов осуществлялись по методике подготовки образцов для молекулярно-генетического анализа с фиксацией в 96 %-ном спирте. После традиционного определения таксономического положения собранных экземпляров идентификация видов происходила методами генетического анализа по нуклеотидной последовательности гена субъединицы 1 цитохром С оксидазы (COI). Работы были проведены в ДНК- лаборатории Музея естественной истории Университета г. Осло (Норвегия). Сборка и расшифровка нуклеотидных последовательностей ДНК исследуемых образцов велись с помощью программ «CodonCodeAligner» и «MEGA-X». В результате исследований удалось выявить полную идентичность ДНК-последовательностей нескольких массовых видов щелкунов, тогда как ряд расшифрованных ДНК-последовательностей модельных экземпляров отсутствовал в генетическом банке, что требует пополнения его новыми данными.

Введение

Развитие молекулярно-генетических методов изучения живой биоты ставит задачи пополнения генетического банка и данных о биологическом разнообразии. Несомненный интерес представляет изучение ДНК-последовательностей важных в научном и практическом отношении видов. Щелкуны (Coleоptera, Elateridae) — семейство жесткокрылых, включающее в мировой фауне более 12000 видов [1]. Почвообитающие личинки многих видов щелкунов с твердыми покровами известны под названием проволочники. Они повреждают подземные части сельскохозяйственных и древесных культур. Другие виды щелкунов играют существенную роль в жизни экосистем в роли деструкторов растительных остатков, ксилофагов, некрофагов или хищников, регулирующих численность беспозвоночных [2–6].

Данные о фауне, экологии и распространении щелкунов Казахстана приводятся в работах Е.Л. Гурьевой, Г.Г. Джилкебаевой, Г.Ж. Ормановой, Н.Г. Скопина, Р.С. Тугушевой и других исследователей [5–9]. Сведения по фауне щелкунов Костанайской области имеются в ряде работ Т.М. Брагиной [10–13]. В составе фауны щелкунов, личинки которых обитают в почве, зарегистрировано 15 видов из 8 родов [11–14].

Целью данной работы было апробирование методов молекулярной идентификации насекомых, которые позволяют определить принадлежность тестируемых образцов к определенному таксону с помощью коротких генетических маркеров в ДНК, называемых штрих-кодированием ДНК. Штриховое кодирование применительно к идентификации зоологических объектов показывает, что митохондриальная геноцитохромекоксидаза I (ИСП) может служить ядром глобальной системы биологической идентификации животных [15].

Методы и материалы

Для генетического анализа было отобрано 16 личинок щелкунов из различных по экологическим условиям и уровню хозяйственного освоения модельных участков на территории Мендыкаринского района Костанайской области: (подзона обыкновенных черноземов, супеси): 1) залежь 5 лет; 2) залежь 32 года; 3) пшеничное поле; 4) целинный степной участок. Отбор личинок проводился методом стандартных почвенно-зоологических проб [16]. После изъятия из почвы личинки помещались в 96 %-ный этиловый спирт. После двух-трех замен фиксирующей жидкости этикетированные образцы были помещены в морозильную камеру. Генетический анализ проводился методом ДНК- баркодирования в лаборатории Музея естественной истории Университета г. Осло (Норвегия). Для подготовки образцов и молекулярно-генетического анализа было выполнено семь последовательных этапов: 1) морфологическая идентификация видов; 2) экстракция ДНК, часть 1; 3) экстракция ДНК, часть 2; 4) ПЦР, Taq-полимераза; 5) гель-электрофорез; 6) очистка; 7) подготовка образцов для секвенирования в StarSEQ. Таксоны приводятся по классификации, принятой в Зоологическом институте РАН [11]. Сборка и расшифровка нуклеотидных последовательностей ДНК исследуемых образцов проводились с помощью программ «CodonCodeAligner» и «MEGA-X». Более подробно методика проведения генетического анализа описана в ранее опубликованных материалах [14].

Результаты и обсуждение

Из образцов от 16 собранных экземпляров личинок щелкунов (проволочников) методом генетического анализа было идентифицировано 3 вида щелкунов, являющихся типичными обитателями степной зоны: Selatosomus latus (3 экз.), Agriotes sputator (1 экз.), Hemicrepidius niger (2 экз.). Краткое описание подтвержденных видов приведено ниже:

1. Selatosomus (Selatosomus) latus (Fabricius, 1801) — Широкий щелкун.

Материал: Костанайская область, Мендыкаринский район, залежь 5 лет, 28.V.2018, 1 экз.; Костанайская область, Мендыкаринский район, пшеничное поле, 22.V.2018, 1 экз.; Костанайская область, Мендыкаринский район, целина, 27.V.2018, 1 экз.

Широко распространен в равнинной части Казахстана (кроме пустынь), заходит в горные степи. На Севере Казахстана отмечается повсеместно. В лесостепи обитает в открытых биотопах; в степях как в открытых местообитаниях с наиболее благоприятным режимом увлажнения, так и под пологом древесной растительности. Зона наибольшей вредоносности — степные и сухостепные районы Западно-Казахстанской, Костанайской, Акмолинской, Павлодарской, Карагандинской, ВосточноКазахстанской областей (повреждает самые разные культуры, особенно кукурузу, ячмень, пшеницу, картофель).

Agriotes (Agriotes) lineatus (Linnaeus, 1758) — Посевной полосатый щелкун.

Материал: Костанайская область, Мендыкаринский район, залежь 5 лет, 28.V.2018, 1 экз.

Обитает в лесостепной и степной зонах, а также в горных степях Казахстана. Массовый вредитель на пашне. Повреждает многие сельскохозяйственные культуры — полевые, хлебные, огородные, многолетние травы, семена, всходы, а также молодые саженцы в садах.

Hemicrepidius niger (Linnaeus, 1758) = Athous niger (Linnaeus, 1758) — Черный щелкун.

Материал: Костанайская область, Мендыкаринский район, залежь 30 лет, 25.V.2018, 1 экз.; Костанайская область, Мендыкаринский район, целина, 27.V.2018, 1 экз.

Распространен преимущественно в лесной и лесостепной зонах Северной и Центральной Европы, в Европейской части стран СНГ (кроме Крайнего Севера и юга), Западной Сибири (до лесотундры), встречается на севере Казахстана. Личинки всеядные, часто наносят вред сельскохозяйственным культурам.

Идентификация щелкунов по личинкам осуществлялась по нуклеотидной последовательности гена субъединицы 1 цитохром С оксидазы (COI). Следует заметить, что ген COI кодируется митохондриальной молекулой ДНК (мтДНК). Результаты секвенирования материала были подвергнуты био- информатическому анализу, в ходе которого нуклеотидная последовательность ДНК, полученная в процессе секвенирования, сравнивалась с различными нуклеотидными последовательностями ДНК, хранящимися в международных базах данных (Генбанке) [16] (см. табл.). При совпадении нуклеотидной последовательности анализируемого вида с видом, внесенным в базу Генбанка, подтверждается вид живого организма.

По девяти экземплярам не были найдены совпадения с ДНК-последовательностями в генетическом банке. Это, вероятно, указывает на отсутствие расшифрованных генетических последовательностей проанализированных видов в базе данных мирового Генетического банка, что требует дальнейших исследований и регистрации идентифицированных видов. Материалы только одного экземпляра не были расшифрованы и ДНК-последовательности не получены (см. табл.).

Таблица

Виды щелкунов и опорные последовательности (GenBank)

Было показано, что для ДНК-баркодирования достаточно малого количества биоматериала для подтверждения точности определения вида (двух одинаковых последовательностей не существует, ошибка исключена). Из недостатков молекулярно-генетических методов следует указать на дорогую стоимость проведения анализа и отсутствие данных в Генбанке по отдельным видам, как, например, по целому ряду проанализированных видов.

Заключение

На основе методов молекулярно-генетического анализа (ДНК-штрихкодирование) были получены данные по полной идентичности ДНК-последовательностей трех видов щелкунов, обитающих на территории Костанайской области (Казахстан): Selatosomus (Selatosomus) latus (Fabricius, 1801), Agriotes (Agriotes) lineatus (Linnaeus, 1758) и Hemicrepidius niger (Linnaeus, 1758), личинки которых являются опасными вредителями сельскохозяйственных культур. Нуклеотидная последовательность ДНК девяти экземпляров щелкунов расшифрована, но идентичные ДНК-последовательности в имеющейся базе данных не обнаружены. Это указывает на отсутствие информации по данным видам, что требует дальнейших исследований и пополнения базы в мировом Генбанке. Наиболее продуктивным является сочетание сравнительно-морфологических методов изучения биологического разнообразия и молекулярно-генетических исследований и расшифровка полного генома организмов.

Благодарность

Авторы благодарят всех лиц, оказавших помощь при выполнении полевых исследований и обработке материалов. Данное исследование проводилось в ходе выполнения инициативной научноисследовательской работы «Оценка влияния землепользования и изменений климата на сообщества почвенных беспозвоночных (мезофауна)» (зарегистрирована в АО НЦГНТЭ, № 0119РКИ0195) и выполнения международного научного проекта «Инновации для устойчивого использования сельскохозяйственных ресурсов и адаптации климата в засушливых степях Казахстана и Юго-Западной Сибири (ReKKS)». Работы по ДНК-баркодированию насекомых проходили в молекулярно-генетической лаборатории Музея естественной истории Университета г. Осло (Норвегия) в период научной стажировки авторов (01.02. – 15.02.2019 г.) в рамках проекта «Training the new generation of entomologists in

DNA-based molecular and genomic methods — international network (EntoMol)» (№ проекта CPEA- 2015/10069).

Список литературы

1. Tarnawski D. A world catalogue of Ctenicerini Fleutiaux, 1936 (Coleoptera: Elateridae: Athoinae) / D. Tarnawski // Genus. Wroclaw. — 1996. — Vol. 7, No. 4. — P. 587–663.
2. Агроэкологический атлас России и сопредельных территорий: экономически значимые растения, их болезни, вредители и сорные растения [Электронный ресурс]. — 2008. — Режим доступа: http://www.agroatlas.ru (дата обращения: 06.04.2020).
3. Гурьева Е.Л. Щелкуны / Е.Л. Гурьева // Биокомплексные исследования в Казахстане. — Л.: Наука, 1969. — Ч. 1. — С. 396–398.
4. Джилкибаева Г.Г. Материалы к изучению щелкунов и их биологии в Алма-Атинской области / Г.Г. Джилкибаева // Изв. АН КазССР. Сер. зоол. — 1950. — Вып. 9. — С. 103–107.
5. Долин В.Г. Определитель личинок жуков-щелкунов фауны СССР / В.Г. Долин. — Киев: Урожай, 1978. — 126 с.
6. Скопин Н.Г. Хрущи, проволочники и ложнопроволочники целинных земель севера Акмолинской области / Н.Г. Скопин // Тр. Ин-та зоол. АН КазССР. — 1958. — Т. VIII. — С. 138–145.
7. Орманова Г.Ж. Таксономический состав жуков-щелкунов (Coleoptera, Elateridae) Казахстана / Г.Ж. Орманова // Фауна Казахстана и сопредельных стран на рубеже веков: материалы Междунар. конф. — Алматы: КазНУ, 2004. — С. 177, 178.
8. Орманова Г.Ж. Экология фоновых видов жуков-щелкунов (Coleoptera, Elateridae) Казахстана / Г.Ж. Орманова // Вестн. КазНУ. Сер. экол. — 2009. — № (26). — С. 40–44.
9. Тугушева Р.С. Предварительные данные по фауне щелкунов (Coleoptera, Elateridae) Казахстана / Р.С. Тугушева // Тр. Ин-та зоол. АН КазССР. — 1968. — Т. 30. — С. 149–156.
10. Брагина Т.М. Анализ биологического разнообразия степей Наурзумского заповедника на примере фауны почвенных беспозвоночных / Т.М. Брагина // Вопросы степеведения. — 2005. — Т. 5. — С. 46–53.
11. Брагина Т.М. Фауна и распределение щелкунов (Coleoptera, Elateridae) в экосистемах Наурзумского заповедника / Т.М. Брагина // КМПИ жаршысы. — 2012. — № 3 (27). — С. 85–88.
12. Брагина Т.М. Население щелкунов (Coleoptera: Elateridae) почвенно-подстилочного яруса природных экосистем Северного Тургая / Т.М. Брагина // XVII Всерос. совещ. по почвенной зоологии: материалы Междунар. конф. — Сыктывкар; М., 2014. — C. 39–41.
13. Брагина Т.М. Природные условия и животный мир государственного природного резервата «Алтын Дала» / Т.М. Брагина, Е.А. Брагин. — Костанай: Костанайполиграфия, 2017. — 236 с.
14. Bragina T.M. The experience in application of molecular genetics methods for insects species identification / Т.М. Bragina, М.А. Bobrenko, M.M. Rulyova // КМПИ жаршысы. — 2020. — № 2 (58) — С. 61–67.
15. Hebert P.D.N. Biological identifications through DNA barcodes / P.D.N. Hebert, A. Cywinska, S.L. Ball, J.R. de Waard // Proc. R. Soc. — 2003. — Vol. 270. — P. 313–322.
16. Сайт Зоологического института РАН. Жуки [Электронный ресурс]. — Режим доступа:https://www.zin.ru/ANIMALIA/COLEOPTERA (дата обращения: 01.06.2020).