Ведение. Лиофилизация – метод сушки, который представляет собой последовательное замораживание объекта и сублимацию растворителя в вакууме [1]. Лиофилизация имеет важное преимущество перед другими способами концентрирования субстанций: отсутствие воздействия высоких температур на образец позволяет сохранить молекулярную структуру и фармакологические свойства действующего вещества. Растворитель не подвергают воздействию высоких температур, что делает сублимационную сушку менее огнеопасной. Однако данный метод не лишен недостатков, из которых можно выделить длительность и энергоемкость процесса, сложность оборудования и высокую гигроскопичность продукта. Неустойчивость вещества при низких температурах обязывает подбирать криопротектор.
Установлено, что лиофилизаты по физико-химическим параметрам выгодно отличаются от простых физических смесей. Таким образом, сублимационную сушку можно применять в фармации как метод оптимизации свойств субстанций [2].
Дигидрокверцетин (ДКВ) – флаванонол, выделяемый из комлевой части древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica) и лиственницы даурской (Larix dahurica). Это соединение зарегистрировано в РФ в качестве фармацевтической субстанции, которая проявляет антиоксидантные, противоопухолевые [3] и противовирусные [4] свойства, оказывает ангио- и нейропротекторное [5] действия. ДКВ имеет низкую биодоступность, что ограничивает спектр его применения. Ранее физико-химические свойства лиофилизатов ДКВ не изучали.
Цель работы: получить водорастворимые модификации дигидрокверцетина путем лиофилизации его этанольного (ДКВс) и ацетонитрильного (ДКВа) растворов и оценить ее влияние на физико-химические свойства.
Материалы и методы: Для приготовления маточного раствора 1 г ДКВ (АО «Аметис», Россия) растворяли в 50 мл этанола денатурированного (Carl Roth GmbH, Германия) или ацетонитрила (Merck, Германия), добавляли 950 мл воды очищенной. Раствор подвергали немедленной глубокой заморозке путем выдерживания маточного раствора в сухом льду при температуре –78 °С в течение 24 ч. Колбу с замороженным образцом подсоединяли к лиофильной сушилке Alpha 1–2 (Martin Christ Gefriertrocknungsan- lagen GmbH, Германия), работающей в режиме разряженной атмосферы (0,35 атм) и пониженной температуры (–55 °С) на протяжении 36 ч. Морфологический анализ полученной субстанции проводили на сканирующем электронном микроскопе JSM-6380LA (JEOL Technics LTD, Япония). Качественный масс- спектрометрический анализ (ESI-MS) метанольно-водных растворов осуществляли в режиме регистрации анионов на спектрометре LC-MS (Advion, США). Спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1H выполняли с предварительным растворением испытуемого образца в ДМСО-d6 на спектрометре Vertex-70 (Bruker, США). Инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье снимали в таблетке с калия бромидом при помощи спектрометра AM-300 (Bruker, USA). Рентгеновскую порошковую дифракцию (РПД) проводили на дифрактометре ARL X’TRA (Thermo Electron Corporation, США). Термический анализ выполняли при нагревании системы от 25 °С до 300 °С на дифференциальном сканирующем калориметре DSC 204 F1 Phoenix (NETZSCH Group, Германия) и термовесах TG 209 F1 Iris (NETZSCH Group, Германия). Тест на растворимость выполняли по методике Фармакопеи ЕАЭС.
Результаты: По данным микроскопии этанольный лиофилизат ДКВ характеризуется волокнистой структурой с гладкой поверхностью. Частицы ДКВа имеют форму полых гибких микротрубок.
Во время лиофилизации не произошло никаких изменений в молекулярной структуре ДКВ, так как на масс-спектрах продуктов синтеза и субстанции присутствует пик молекулярного иона с отношением m/z, равным 302,7. Используя метод ЯМР 1Н, была получена информация о примесях, имеющихся в составе твердой фазы модификаций ДКВ. Так, в спектре ДКВс наблюдают сигналы, указывающие на присутствие следовых количеств этанола (триплет и квадруплет с химическими сдвигами 1,226 м.д. и 3,687 м.д., соответственно). На спектре ацетонитрильного продукта отсутствует резонансный сигнал протонов метильной группы растворителя. ИК-спектры исследуемых образцов различаются интенсивностью и шириной полосы поглощения фенольных гидроксильных групп (O-Hν при 3402 см-1). В области отпечатков пальцев спектры также не идентичны, что указывает на различия в структуре твердой фазы.
Лиофилизаты ДКВ представляют собой аморфные формы, на что указывает характерное гало на их дифрактограммах, полученных методом РПД, с максимумами при 15,48° и 24,88° для ДКВс и при 17,64° и 25,60° для ДКВа. Дифрактограмма исходного образца обладает профилем, характерным для кристалличес-кой фазы. При нагревании лиофилизатов наблюдали кристаллизацию аморфных форм. Температура фазового перехода ДКВс составляет 155,7°C, а ДКВа – 154,5°C.
Для лиофилизатов наблюдали увеличение растворимости в воде при комнатной температуре: исход-ная субстанция - «очень плохо растворим», ДКВа - «плохо растворим». ДКВэ - «растворим».
Выводы:
Новые модификации ДКВ были получены путем лиофилизации и имели аморфное строение; характеризуются повышенной растворимостью в воде при комнатной температуре. Полученные результаты является важным шагом на пути повышения биологической доступности данного биофлавоноида.
Литература
- Rey, L., May, J. C. Freeze drying/lyophilization of pharmaceutical and biological products (3rd ed.). New York: Informa Healthcare, 2010.
- De Jesús Valle M. J. Lyophilized tablets for focal delivery of fluconazole and itraconazole through vaginal mucosa, rational design and in vitro evaluation / M. J. de Jesús Valle, P. Coutinho, M. P. Ribeiro, A. S. Navarro // European Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2018. – 122: P. 144-151.
- Luo, H. Inhibition of Cell Growth and VEGF Expression in Ovarian Cancer Cells by Flavonoids / H. Luo, B-H. Jiang, S. King, Y. Chen // Charlie Nutrition and Cancer. - 2008. - 60 (6): P. 800–809.
- Fischer, A. Potential inhibitors for novel coronavirus protease identified by virtual screening of 606 million compounds / M. Sellner, S. Neranjan, M. Smieško, M. A. Lill // International journal of molecular sciences. – 2020. – 21 (10): 3626.
- Saito, S. Taxifolin is a novel therapeutic agent for Alzheimer’s disease and cerebral amyloid angiopathy: Preclinical small‐molecule drug discovery / S. Saito, M. Tanaka, N. Satoh‐Asahara et al. // Alzheimer's & Dementia. – 2020. – 16: e042762.