Изучение распределения атомоксетина в тканях и органах крыс

Резюме

Атомоксетин применяют для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью. Изучено распределение атомоксетина в органах и тканях крыс после внутрижелудочного введения дозы лекарственного вещества, соответствующей LD50 для исследуемых лабораторных животных. Количественное определение атомоксетина в экстрактах из биологического материала проводили УФ-спектрофотометрическим методом. Наибольшее содержание лекарственного вещества обнаружено в желудке, кишечнике, сердце и печени. Указанные выше органы могут быть рекомендованы в качестве объектов судебно-токсикологического исследования на присутствие атомоксетина.

Ключевые слова: атомоксетин, распределение в органах, УФ-спектрофотометрия.

Для профилактики отравлений лекарственными препаратами важное значение имеют результаты химико-токсикологического анализа, направленного на идентификацию лекарственного вещества, которое явилось причиной отравления. Согласно данным Европейского мониторингового Центра по наркотикам и наркомании (EMCDDA), из 7000 – 8000 летальных лекарственных отравлений, ежегодно регистрируемых в Европе в течение последнего десятилетия, более 85 % были диагностированы на основе результатов токсикологических исследований [1].

Атомоксетин, используемый для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью, а также в комплексной фармакотерапии депрессий различной этиологии [2], неоднократно упомянут в специальной литературе в связи с острыми и летальными интоксикациями в результате приема лекарственных средств [3–4]. Разработаны биоаналитические методы определения атомоксетина в плазме крови с помощью таких методов инструментального анализа как высокоэффективная жидкостная хроматография [3] и капиллярный электрофорез [5]. Систематические исследования по разработке методов определения атомоксетина в биологическом материале, пригодных для целей судебно-токсикологических исследований, не проводились.

Целью настоящего исследования явилось изучение распределения атомоксетина в органах и тканях лабораторных крыс после внутрижелудочного введения.

Материалы и методы. В эксперименте были использованы крысы массой 150 – 200 г, которые не получали пищу в течение суток. В желудок с помощью зонда вводили 320 мг/кг атомоксетина (в 2,5 мл дистиллированной воды), что соответствовало LD50 для указанных животных [6]. Через 30 мин животные принимали боковое положение и не меняли его до конца эксперимента. Прекращение сердцебиения крыс наблюдалось через 1,5 часа после начала эксперимента.

Для исследования брали сердце, печень, почки, селезенку, мозг, кишечник с содержимым, желудок с содержимым, кровь. Ткани органов гомогенизировали и обезвоживали путем растирания с тройным количеством безводного сульфата натрия. Полученную сыпучую массу переносили в стеклянную бюретку с закрепленной сверху делительной воронкой, в которую помещали 20 мл хлороформа. Атомоксетин элюировали из гомогенизированных тканей хлороформом. Полученный элюат очищали, взбалтывая с 15 мл воды, подщелоченной 25 % раствором аммония гидроксида до рН 8, водные фазы отбрасывали, а хлороформный элюат упаривали на водяной бане при температуре не выше 40ºС. Сухой остаток растворяли в 10 мл н-гексана, переносили в делительную воронку и проводили трехкратную экстракцию атомоксетина ацетонитрилом по 5 мл каждый раз. Ацетонитрил упаривали до удаления органического растворителя, сухой остаток растворяли в 10 мл хлороформа и проводили ТСХ-очистку полученного экстракта.

Методика изолирования атомоксетина из крови. К исследуемой крови прибавляли 5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивали и смесь центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Центрифугат сливали и экстрагировали биологические примеси 10 мл диэтилового эфира (по 5 мл дважды). Фазу органического растворителя отбрасывали, водную фазу подщелачивали 20 % раствором гидроксида натрия до рН 11 – 12, насыщали ее сульфатом аммония и дважды экстрагировали атомоксетин хлороформом по 5 мл каждый раз. Полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр с 0,5 г безводного сульфата натрия, упаривали до минимального объема (0,05 мл) и наносили полосой на линию старта хроматографической пластины для проведения ТСХ-очистки.

Методика ТСХ-очистки. Хлороформный экстракт помещали в фарфоровую чашку, выпаривали до минимального объема (0,05 мл) и наносили полосой на линию старта хроматографической пластины Merck. На расстоянии 2 см от указаной пробы наносили 10 мкл стандартного раствора атомоксетина в метаноле с концентрацией 2 мг/мл. Хроматограмму развивали в хлороформе, а затем, после высушивания на воздухе, в подвижной фазе этилацетат – метанол – 25% раствор гидроксида аммония (85:10:5). Полосу на хроматограмме, соответствующую стандартному раствору атомоксетина, проявляли реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье, оставляя необработанной часть хроматограммы, соответствующей экстракту из биологического материала. С непроявленной полосы хроматограммы на уровне, который соответствовал пятну атомоксетина, препарат элюировали 4 мл метанола.

Количественное определение атомоксетина в элюатах проводили УФ-спектрофотометрическим методом. Для этого метанольный элюат выпаривали, сухой остаток растворяли в 5 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и исследовали УФ-спектр полученного раствора на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО) в диапазоне длин волн 225 – 320 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали растворы, полученные в холостых опытах с соответствующими органами животных. Концентрацию препарата в элюате (x, мкг/мл) рассчитывали по уравнению калибровочного графика: y = (0,00455 ± 4·10-5)x + (0,016 ± 0,005) (при λmax 270 нм) [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования на животных проводились в соответствии с требованиями, которые регламентируются нормативными документами, и входят в комплекс доклинических исследований, необходимых для изучения безопасности лекарственных средств: приказы МЗ Украины № 944 от 14.12.2009 г., № 95 от 16.02.2009 г., № 460 от 23.07.2015 г., требования GLP, правила «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986 г.) [8].

Выделение атомоксентина из органов отравленных животных проводили элюированием препарата липофильным растворителем хлороформом из биологического материала, гомогенизированного и обезвоженного растиранием с безводным сульфатом натрия, с последующей экстракционной очисткой в системе неводных растворителей н-гексан – ацетонитрил. Данная методика разработана нами для изолирования липофильных лекарственных веществ [9]. Атомоксетинн является липофильным соединением, о чем свидетельствуют высокие значения коэффициента липофильности log P(octanol/water) = 4,23) и объема распределения Vd = 8,5 л/кг [3].

Методика изолирования атомоксетина из крови была оптимизирована на основании полученных нами экспериментальных данных о степени экстракции препарата из водных растворов в зависимости от природы органического растворителя, рН водной фазы и присутствия высаливателей [10].

Условия ТСХ-очистки были выбраны на основании ранее проведенных исследований по визуализации и установлению хроматографической подвижности атомоксетина в подвижных фазах, рекомендованных Международной ассоциацией судебных токсикологов (TIAFT) для общего ТСХ-скрининга [11]. Степень элюирования атомоксетина с хроматограмм метанолом составляла 99,4 %.

УФ-спектры исследуемых элюатов были аналогичными спектру стандартного раствора атомоксетина в 0,1 М соляной кислоте [10] и имели максимумы поглощения при длинах волн 270 ± 2 и 277 ± 2 нм. В УФ- спектрах холостых элюатов максимумов светопоглощения при указанных длинах волн не наблюдали. Уравнение калибровочного графика для количественного определения атомоксетина методом УФ- спектрофотометрии было получено с использованием серии стандартных растворов препарата в 0,1 М растворе соляной кислоты. Методика линейна в пределах концентраций атомоксетина 15,0 – 210 мкг/мл, значения LOD и LOQ составили соответственно 1,8 мкг/мл и 5,6 мкг/мл [7].

Результаты по определению содержания атомоксетина в органах и тканях, полученные УФ- спектрофотометрическим методом, с учетом эффективности использованных методик пробоподготовки, представлены в табл.

Таблица - Распределение атомоксетина в тканях и органах крыс

Масса крысы, г

Введено атомоксети на, мг

Объект исследования

Масса объекта, г

Найдено атомоксетина, мг

во взятом объекте

в пересчете на 100 г объекта

1

2

3

4

5

6

193 г

61,8

сердце

0,535

0,048

9,065

печень

5,811

0,507

8,717

почки

1,333

0,032

2,401

легкие

1,306

0,061

4,634

селезенка

0,911

0,028

3,073

мозг

3,166

0,127

4,011

кишечник с содержимым

12,676

4,772

37,646

желудок с содержимым

2,779

9,124

328,320

кровь

5,822

0,131

2,250

207 г

66,3

сердце

0,621

0,071

11,433

печень

6,033

0,488

8,089

почки

1,414

0,046

3,253

легкие

1,368

0,077

5,629

селезенка

0,962

0,035

3,638

мозг

3,188

0,143

4,486

кишечник с содержимым

14,263

5,618

39,389

желудок с содержимым

2,915

8,676

297,633

кровь

6,416

0,153

2,385

187

59,9

сердце

0,511

0,080

15,656

печень

5,436

0,412

7,579

почки

1,273

0,030

2,357

легкие

1,204

0,086

7,143

селезенка

0,861

0,029

3,368

мозг

2,952

0,161

5,454

кишечник с

содержимым

13,127

4,084

31,111

желудок с содержимым

2,813

8,336

296,338

кровь

5,537

0,124

2,239

Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что после внутрижелудочного введения среднелетальной дозы атомоксетина в организм крысы наибольшее содержание лекарственного вещества обнаружено в желудке, кишечнике, сердце и печени. Указанные выше органы могут быть рекомендо-ваны в качестве объектов судебно-токсикологического исследования на присутствие атомоксетина.

Литература

  1. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction. Technical report: An analysis of post-mortem toxicology practices in drug-related death cases in Europe. – Luxembourg : Publications Office of the European Union, 2019. – 52 p.
  2. Treuer, T. A systematic review of combination therapy with stimulants and atomoxetine for attention- deficit/hyperactivity disorder, including patient characteristics, treatment strategies, effectiveness, and tolerability / T. Treuer, S. S. Gau, L. Méndez, W. Montgomery, J. A. Monk, M. Altin, H. J. Dueñas // J. Child Adolesc. Psychopharmacol. – 2013. – Vol. 23, Issue 3. – P. 179193.
  3. Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material: 4-th edition / Ed. by A. C. Moffat, M. D. Osselton, B. Widdop. – London, Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. – 2736 p.
  4. Garside, D. Postmortem tissue distribution of atomoxetine following fatal and nonfatal doses – three case reports / D. Garside, J. D. Ropero-Miller, E. C. Riemer // J. Forensic Sci. – 2006. – Vol. 51 (1). – P. 179–182.
  5. Capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence for determination of atomoxetine hydrochloride and the study on its interactions with three proteins / H. J. Zeng, R. Yang, Y. Zhang et al. // Luminescence. - 2015.- Vol. 30, Issue 2.- P. 124-130.
  6. Strattera capsule: material safety data sheet : Version 1.5 : [Electronic resource] – Lilly, 2010. – 8 p. – Available at : Shttps://s3-us-west-2.amazonaws.com/drugbank/msds/DB00289.pdf?1552515589 (date of the application : (04.09.2019).
  7. Томаровська, Л. Ю. Розробка УФ-спектрофотометричного та екстракційно-спектрофотометричного методів кількісного визначення атомоксетину, придатних для хіміко-токсикологічного аналізу / Л. Ю. Томаровська, С. В. Баюрка, С. А. Карпушина // Вісник фармації. – 2017. – № 4 (92). – С. 15 – 19.
  8. Директива Совета ЕС о сближении законов, постановлений и администрирование положений государств ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (86/609/ЕЕС) // В кн.: Надлежащая производственная практика лекарственных средств // Под ред. Н.А. Ляпунова, В.А. Загория, В.П. Георгиевского, Е.П. Безуглой. – Киев:"Морион", 1999. – С. 508-545.
  9. Пат. на корисну модель 95171 Україна, мпк7 G01N 33/15 (2006.01). Cпосіб виділення амітриптиліну та інших ліпофільних речовин з біологічного матеріалу / Баюрка С. В., Петюнін Г. П., Карпушина С. А. ; власник Національний фармацевтичний університет. – № u 2014 07572 ; заявл. 07.07.2014 ; опубл. 10.12.2014, Бюл. №23. – 3 с.
  10. Томаровская, Л. Ю., Разработка биоаналитической методики определения атомоксетина методом ВЭЖХ / Л.Ю. Томаровська, С.В. Баюрка, С.А. Карпушина //Фармация Казахстана.–2019. –Т. 211,№ 2.- С.17-20.
  11. Томаровська, Л.Ю.Розробка методів ідентифікації атомоксетину, придатних для хіміко-токсикологічного аналізу // Л. Ю. Томаровська, С. В. Баюрка, С. А. Карпушина // Вісник фармації. – 2017. – № 2 (90). – С. 13 – 20.
Год: 2019
Город: Шымкент
Категория: Медицина