Разработка методов идентификации и количественного определения трентала, пригодных для целей химико-токсикологического анализа

Резюме

В данной статье приведены методы идентификации и количественного определения, которые можно использовать при проведении химико-токсикологического анализа биологического материала на трентал. Предложены методики определения трентала с использованием хроматографии в тонком слое сорбента, УФ- спектроскопии, реакций окрашивания. Изучены оптимальные условия для проведения количественного определения трентала с использованием УФ-спектрофотометрии, которая позволяет определить препарат в пределах концентраций 1,5-40 мкг/мл в этаноле и 3,0-40 мкг/мл в 0,1М растворе кислоты хлористоводородной.

Ключевые слова: трентал, идентификация, метод ТСХ, УФ-спектроскопия, количественное определение

Актуальной проблемой нашего времени является изучение, лечение и предупреждение патологических состояний, вызванных химическими веществами. Широкое использование как известных ранее, так и вновь синтезированных химических соединений создает предпосылку к росту числа отравлений. В современной медицине широко используются препараты, производные группы пурина, оказывающие стимулирующее действие на центральную нервную систему и сердце, расширяющие сосуды. Препараты группы пурина обладают ценными фармакологическими свойствами, но в определенных условиях могут проявлять токсический эффект [1-3]. Известны случаи отравления этими препаратами [4], вследствие чего они представляют интерес в химико-токсикологическом отношении. Объектом нашего исследования является трентал, который назначают при нарушении периферического кровообращения (болезни Рейно, ендатермии) и цереброваскулярной патологии (ишемических и атеросклеротических состояниях), при диабетической нефроангиопатии, при сосудистой патологии глазного дна и др [5]. Литературные данные о химикотоксикологическом анализе трентала практически отсутствуют, что свидетельствует о необходимости изучения и разработки методов идентификации и количественного определения трентала.

Цель исследования: Разработка методов идентификации и количественного определения трентала, пригодных для целей химико-токсикологического анализа

Результаты и обсуждение: Одним из важных этапов химико-токсикологического анализа является этап идентификации токсического вещества. Для идентификации трентала в химико-токсикологическом анализе широко используют химические, хроматографические (ГЖХ, ВЭЖХ, ТСХ), спектральные (УФ, ИК, масс- спектрометрия) и другие методы. [6] Довольно часто при идентификации нативного вещества, а так же его метаболитов используется сочетание различных методов анализа, так как на практике использование одного метода недостаточно. Так в химико-токсикологическом анализе химические методы (цветные реакции, микрокристаллоскопических) находят широкое применение в сочетании со спектральными или хроматографическими методами. Трентал, как и большинство других соединений группы пурина, дает положительную мурексидную пробу, образуя аммонийную соль тетраметилпурпуровой кислоты, имеющей розово-фиолетовую окраску. Чувствительность реакции составляет 50 мкг в пробе. С общеалкалоидными реактивами, растворами солей, с иодидным, роданидным и другими комплексами тяжелых металлов трентал дает микрокристаллические реакции. Результаты наиболее характерных микрокристаллических реакций представлены в таблице № 1.

Таблица 1-Результаты осадительных и микрокристаллических реакций на трентал

4.

Марме

Кристаллы в виде звездочек 2,5

Реактивы для приготовления микрокристаллоскопических реакций готовились согласно методикам, описанных в литературе [7] и использовались свежеприготовленными. Следует помнить, что при высыхании капель, реагирующих компонентов на предметном стекле, могут образовываться кристаллы от избытка реактива, которые можно ошибочно принять за кристаллы – результат взаимодействия препарата с реактивом. Поэтому, изучение образующихся кристаллов производили во влажной камере, при температуре 20⁰С. За последнее время наиболее пристальное внимание уделяют хроматографическим методам исследования, так как эти методы отличаются высокой чувствитель-ностью и могут использоваться как в фармацевтическом анализе так и химико-токсико-логическом анализе.

Согласно данным литературы одним из распространенных хроматографических методов обнаружения веществ в химико-токсикологическом анализе является хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ). [6,8] Метод ТСХ доступен, прост в исполнении, имеет значительную распредели-тельную способность и скорость выполнения анализа. Для исследования лекарственных веществ предложен ряд систем растворителей, которые хорошо воспроизводят значения величины Rf [7] и обладают высокой разрешающей способностью. Наше исследование проводились с водно-спиртовым раствором трентала. Исследуемый раствор получали из таблеток. Для этого 10 таблеток препарата измельчали в ступке, растворяли в 100 мл воды, подкисляли кристаллической щавелевой кислотой до рН 2-3, после чего перемешивали 60 минут, фильтровали, далее проводили экстракцию хлороформом 3 раза по 15 минут. Подщелачивали водную фазу 25% раствором аммиака до рН 8-9 и проводили экстракцию хлороформом 3 раза по 15 минут. Все хлороформные вытяжки объединяли, растворитель выпаривали при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в спирте. Для проведения хроматографических исследований мы использовали стеклянные пластинки для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЕТШХ, производство Эстония, силикагель КСКГ, фракция 5:20 мкм, толщина слоя 130 ± 25 мкм, размер пластинки 20х20 см), пластинки Сорбфил (силикагель СТХ-ПА, фракция 5:17 мкм, тип подложки ПЭТФ-Е). Прежде чем проводить исследования на хроматогра-фических пластинках с различными системами растворителей, нами были отобраны проявители с учетом их чувствительности. С этой целью на хроматографические пластинки последовательно наносили в разные точки пробы трентала с содержанием от 1 до 20 мкг и обрабатывали различными проявителями. Как проявители мы использовали пары йода, бромфеноловый синий, 5% раствор нитропруссида натрия. Результаты представлены в таблице № 2.

Таблица2 - Цвет пятен трентала и чувствительность проявителей на хроматограммах

На следующем этапе была поставлена задача, подобрать оптимальные системы подвижных растворителей для хроматографирования трентала. Для этого использовали системы растворителей кислого, нейтрального и щелочного характера, состав которых приведен ниже. Выбор оптимальных систем растворителей различной полярности проводили с учетом их способности давать значения величин Rf, которые по данным литературы [6] в оптимальном случае должны быть близкими к 0,5. Хроматографирование проводили в камере объемом 2000 см³, в которую вносили по 100 мл растворителей. Камеру насыщали в течение 30 минут. На линию старта на расстоянии 2 см от края наносили образцы 0,1% водно-спиртового раствора трентала, которые содержали от 1 до 20 мкг препарата. Путь пробега растворителей составлял 10 см. После достижения растворителями линии финиша, пластинки вынимали из камеры, высушивали при комнатной температуре и проявляли пятна исследуемого вещества. При использовании системы растворителей в системе толуол-ацетон-этанол-аммиак (45: 35: 10: 7) Rf составляла 0,73 (для пластинок ВЕТСХ) и 0,57 (для пластинок Сорбфил), в системе бензол-этанол Rf составляла 0,48 (для пластинок Сорбфил), на пластинках ВЕТСХ препарат остался на линии старта, в системе толуол-ацетон-этанол-аммиак (45: 45: 7: 3) Rf составляла 0,53 (для пластинок ВЕТШХ) и 0,48 (для пластинок Сорбфил), в системе бензол-этанол-уксусная кислота (75: 24: 1) Rf трентала составляла 0,61 (для пластинок ВЕТСХ) и 0,33 (для пластинок Сорбфил).

Также для идентификации мы предложили использовать метод УФ-спектроскопии. Метод характеризуется высокой чувствительностью, достаточно прост в использовании, дает надежные результаты в исследовании. Метод позволяет точно измерить светопоглощение исследуемых веществ при определенной длине волны. Обнаружение веществ проводится по их спектрам поглощения. Для идентификации трентала нами были изучены УФ-спектры 0,002% раствора трентала в различных растворах (1М, 0,1 М, 0,01М) соляной кислоты, хлороформе, этаноле, 0,1 М растворе натрия гидроксида, диметилформамиде. Измерения проводили на спектрофотометре «Specord M 40» (толщина слоя 1 см). Было установлено, что в области длин волн 210-310 нм во всех исследуемых растворах трентал имеет четкий максимум светопоглощения: в 1М растворе соляной кислоты при λmax= 268 ± 1нм; в 0,1М растворе соляной кислоты при λmax= 269 ± 1нм; в 0,01М растворе соляной кислоты при λmax= 272 ± 1нм, в этаноле при λmax= 273 ± 1нм, в хлороформе при λmax= 275 ± 1нм; в 0,1 М растворе гидроксида натрия при λmax= 273 ± 1нм; в диметилформамиде при λmax= 275 ± 1нм.

Для количественного определения трентала использовали данные спектров в этаноле и в 0,1М растворе соляной кислоты, т.к. с хлороформным раствором работать неудобно, в связи с тем что он летуч, в растворе гидроксида натрия отмечается наименьшая интенсивность светопоглощения в сравнении с другими использованными растворителями при одинаковых концентрациях трамала. Зависимость оптической плотности от концентрации изучали в соответствии с нижеуказанной методикой. В мерные колбы на 10 мл вносили 0,02% раствор трентала в этаноле или в 0,1 М соляной кислоты в соответствующих концентрациях 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500 мкг и доводили вышеуказанными растворителями до метки. После перемешивания растворов проводили определение их оптической плотности при λmax= 273 для этанольного раствора и при λmax= 272 для кислого раствора на спектрофотометре «Specord M 40» (толщина слоя 1 см), строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации. Данная методика позволяет определить препарат в пределах концентраций 1,5-40 мкг/мл в этаноле и 3,0-40 мкг/мл в 0,1М растворе соляной кислоты.

Выводы. Установлено, что наиболее чувствительными и характерными являются реакции с реактивом Марме и 1% пикриновой кислотой. Разработаны условия обнаружения трентала с использованием метода хроматографии в тонких слоях сорбента. Оптимальной системой растворителей предложена система толуол- ацетон-этанол-аммиак (45:45:7:3), предел обнаружения трентала составляет 5 мкг в пробе (проявитель реактив бромфеноловый синий). Получены УФ-спектры трентала в растворах соляной кислоты, хлороформе, гидроксиде натрия, диметилформамиде. Разработана методика количественного определения трентала с помощью УФ- спектрофотометрии.

Литература

1. Клиническая токсикология детей и подростков / Под ред. И.В. Марковой, В.В. Афанасьевой, Э.К. Цибулькина, М.В. Неженцева. – СПб. 1998. – С.262-268.
2. Лужников, Е.А., Острые отравления: Рук-во для врачей / Е.А. Лужников, Л.Г. Костомарова. – М.: Медицина, 2000. – 125 с.
3. Goldgran-Toledano, D. Toxicologie Clinique / D. Goldgran-Toledano, F.Xanthines Baud. – Paris: Medecine-science Flammarion, 2000. - P.217-223.
4. Провадо, И.П. Редкие формы отравления препаратами теофиллина. / Прадо И.П., Зобнин Ю.В., Любимов Б.М. и др. // Сибирский медицинский журнал. – 2006. - № 2 – С.85-87.
5. Машковский, М.Д. Лекарственные средства:Пособие для врачей / М.Д. Машковский. – М.: Новая волна, 2008. – 1206 с.
6. Clarke’s analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material: 4-th edition / A. C. Moffat; M. D. Osselton; B. Widdop [et al.]. – London, Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. – 2736 p.
7. Крамаренко, В.П. Токсикологічна хімія / В.П. Крамаренко. - Київ: Вища шк., 1995. – 423 с.
8. Полуян, С.М. Ідентифікація бромгексину за допомогою тонкошарової хроматографії, кольорових реакцій / С.М. Полуян, В.В. Болотов, В.С. Бондар та ін. // Вісник фармації. – 2000. - №2 (22). – С.11-13.