Определение аминокислотного состава травы клевера земляничного методом ВЭЖХ

АННОТАЦИЯ

Впервые изучен аминокислотный состав надземной части клевера земляничного методом ВЭЖХ, произрастающего в Узбекистане. Установлено, что специфический набор аминокислот изучаемого растения включает 20 аминокислот, из которых 9 являются незаменимые.

Ключевые слова: клевер земляничный, свободные аминокислоты, связанные аминокислоты, высоко эффективная жидкостная хроматография.

Аминокислоты имеют выраженные фармако-терапевтические свойства. Некоторые из ных оказывают положительное влияние на сердечно-сосудистою систему, участвуют в процессах нервной регуляции, влияют на сосудистой тонус. Так, аргинин и глутаминовая кислота обладают антиоксидантным и гепатопротекторным действием, а также оказывают мембраностабилизирующий эффект. Они повыщают жизнеспособность тромбоцитов на моделях токсического воздействия тетрациклина и четыреххлористого углерода. Аланин и глицин регулируют уровен сахара в крови, участвуют в регенерации тканей. Серин обеспечивает запасы гликогена в печени и мышцах; он также важен для процессов обмена жиров и др. [1].

Лекарственные растения как потенциальные источники аминокислот изучены пока недостаточно, например, клевер земляничный (Trifolium fragiferum L.) [2]. В странах Востока применялось как

диуретическое и при болезнях селезенки.

Цель исследования – изучить состав аминокислот в траве клевера земляничного.

Экспериментальная часть. Для исследования аминокислотного состава использовали воздушно– сухую траву клевера земляничного, заготовленную в июле 2018г. в Джаркурганском районе Сурхандарьинской области.

Качественное определения аминокислот проводили в водных извлечениях с помощью нингидриновой реакции и хроматографически. Для этого 10 г воздушно-сухого измельченного сырья заливали 100 мл воды очищенной и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин. Извлечение фильтровали, сырье вновь заливали 75 мл воды очищенной и экстракцию повторяли еще дважды. Водные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом до 50 мл и использовали для проведения для качественных и хроматографического анализа.

При качественном анализе смешивали равные объемы исследуемых извлечений и 0,1% раствор свежеприготовленного раствора нингидрина и осторожно нагревали. При охлаждение появлялось краснофиолетовое окрашивание, что указывало на присутствие аминокислот в сырье клевера земляничного.

Хроматографический анализ проводили в тонком слое сорбента. Полученные извлечения наносили на подготовленные хроматографические пластинки «Силуфол» и хроматографировали в системе растворителей (концентрированный аммиак – 96% спирт этиловый в соотношении 9:32) параллельно с достоверными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 0,2% спиртовым раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при 1050 С в течение нескольких минут. Аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен. В траве клевера земляничного обнаружено 20 аминокислот, в том числе – 9 незаменимых.

Определение свободных аминокислот: Для проведения анализа измельчали сырье с помощью кофемолки и около 400 мг (точная навеска), воздушно–сухого образца суспендировали в пластиковых пробирках с помощью виброустановки Eppendorf (США) в 10 мл 10% -ТХУ (трихлор уксусная кислота) в комнатной температуре в течение 30 мин. Суспензию центрифугировали с помощью центрифуги Eppendorf (США) 14000 об/мин, 3 мин для удаления нерастворимых частиц.

Идентификацию и количественное определение аминокислот в осветленном растворе проводили после их превращения в фенилтиокарбамоильные (ФТК) производные методом ВЭЖХ на обращено- фазовой колонке [3]. Количественные расчеты проводили относительно хроматограмм ФТК-производного стандартной смеси аминокислот (Sigma, США). Хроматографию проводили с помощью хроматографа Beckman System Gold (Beckman,США) (рис.1).

Условия хроматографии:

  • Column – Ultrasphere ODS 0.46 Ч 25cm, 5µm, Beckman;
  • Mobile phase – «A» - 5% acetonitrile in 20 mM Na-acetate (pH 6.4),

«B» - 60% acetonitrile in water, flow 1 ml/min, pump program 0-min 2% B, 1-17 min linear gradient B from 2 to 48%, 17-20 min 100%B.

  • Detection – 280 nm, 0.01 AUFs.
  • Thermosta – 400C.

Связанные аминокислоты определяли после гидролиза хлористоводородной кислотой.

55

Таблица 1 – Аминокислотный состав надземной части клевера земляничного

Заменимые аминокислоты

Содержание свободных аминокислот, мг %

Содержание связанных аминокислот, мг %

Аланин

0,087

0,17

Аспарагиновая кислота

0,217

0,27

Глицин

0,146

0,20

Глутаминовая кислота

0,499

0,13

Aспарагин

0,120

-

Пролин

0,007

-

Серин

0,075

0,16

Тирозин

0,183

0,14

Цистеин

0,005

-

Аргинин*

0,051

0,18

Валин*

0,183

0,15

Гистидин*

0,003

0,09

Изолейцин*

0,021

0,18

Лейцин*

0,042

0,28

Лизин*

0,008

0,17

Метионин*

0,009

0,04

Триптофан

0,040

-

Треонин*

0,042

0,15

Фенилаланин*

0,077

0,14

Глутамин

0,080

-

Сумма аминокислот

1,712

2,13

Незаменимые аминокислоты

   

Выводы:

1. В результате проведенного исследования впервые установлен состав аминокислот надземной части клевера земляничного.

2. Показано, что общее содержание аминокислот в траве клевера земляничного идентифицировано 20 свободных и 15 связанных аминокислот, суммарное содержание которых составляет 1,712% и 2,13% соответственно (в том числе – 9 незаменимых).

Список литературы

  1. Халилова Ш.Р., Пулатова Д.К., Урманова Ф.Ф. Изучение аминокислотного состава травы клевера лугового // Фармацевтический журнал, 2013. – №2. – С.29-33.
  2. Флора Узбекистана. 3 т. – Ташкент: изд. АН УзССР, 1955. – С. 439-445.
  3. Darbe A. Practical protein chemistry, a hand book, Jonh Wiley and Soans Ltd. – 1987. – P.250-275.
Теги: США
Год: 2018
Город: Шымкент
Категория: Медицина