Актуальность. Человеческие нейтрофилы являются наиболее многочисленными клетками в врожденном иммунитете. Основная и критическая роль нейтрофилов заключается в обнаружении, миграции и инициировании воспаления против патогенов или поврежденной области. Воспалительный ответ должен быть строго регламентирован, иначе организм хозяина будет подвергаться воспалению дольше необходимого или станет хроническим [1]. SIGLEC является сиаловой кислотой (гликаном) - признанными иммуноглобулиноподобными (Ig-подобными) рецепторами с ингибирующими мотивами в цитоплазматическом домене, которые выражаются в основном на линиях иммунных клеток. Нейтрофилы выражаются SIGLEC5/14 и SIGLEC9 рецепторами соответственно[2].
Молекулярная характеристика рецепторов SIGLEC в основном проводится на трансфицирован-ных клетках, но не на первичных человеческих нейтрофилах. Эти исследования лучше объясняют природу
10
SIGLEC на поверхности иммунных клеток. SIGLEC плохо изучены на первичных нейтрофилах по сравнению с трансгенными клеточными линиями. Их природа может варьироваться в терминах гликозилирования, присутствия, местоположения и активности.
Цель и задачи.Молекулярная характеристика SIGLEC5/14 и SIGLEC9 у человеческих нейтрофилов.
Материалы и методы исследования. Иммунопреципитация - концентрация белков с различными антителами (моно/поликлональные антитела). Градиент плотности сахарозы - альтернативный метод концентрирования и использования различных методов осаждения. N-гликозидаза PNGase F - уменьшает молекулярный вес, чтобы получить право от SIGLEC. SDS-PAGE и Western Blot - обнаружение SIGLEC. [2]
Результаты и обсуждения. Обнаруженные SIGLEC на человеческих нейтрофилах отдыхают и активны, и никакой большой разницы не обнаружено. Оптимизированные методы получения концентрированного белка на поверхности нейтрофилов, IP-антитела, мешающие вторичным блоттинго-вым антителам. Была использована альтернативную очистку и концентрацию белка. N-гликозидаза удаляет гликаны, покрытые SIGLEC. [1,2] Никакой большой разницы в природе SIGLECs в покоящихся и активных нейтрофилах не обнаружено. Уменьшение гликанов может привести к распознаванию антител.
Выводы. SIGLEC похож на трансмембранные молекулы, сильно гликозилированные. Градиент плотности сахарозы предпочтительнее в качестве альтернативного метода концентрирования SIGLEC. Удаляя гликаны с поверхности SIGLEC, можно обнаружить уменьшение молекулярного веса, близкое к диапазону ожиданий. Точное обнаружение SIGLEC поможет обнаружить любую разницу в поведении, экспрессии и локализации в разных условиях на нейтрофилах.
Список литературы
- Angata, T., Hayakawa, T., Yamanaka, M., Varki, A. & Nakamura, M. Discovery of Siglec-14, a novel sialic acid receptor undergoing concerted evolution with Siglec-5 in primates. FASEB J 20, 1964-1973 (2006).
- Angata, T. & Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: an evolutionary perspective. Chem Rev 102, 439-469 (2002)