На сегодняшний день одним из современных методов контроля токсичности загрязнения окружающей среды и токсического действия на организм человека химических, косметических, фармацевтических, биотехнологических и многочисленных промышленных продуктов является биотестирование. Данный метод контроля основан на реакции тест-объекта на токсическое действие того или иного продукта, вещества. С развитием биологии и биотехнологии используют большое разнообразие тест-объектов. Тест-объекты – это высокочувствительные организмы, которые представлены в пределах географического региона, доступны для культивирования и хорошо изучены. В качестве тест-объектов при проведении биотестирования, в зависимости от целей и условий проведения исследований, можно использовать светящиеся бактерии, дафнии, рыбы, простейшие, водоросли и др. [1, 2, 4].

Одним из биоиндикаторов является инфузория Paramecium caudatum. Ее особенностью является то, что Paramecium caudatum не имеют нервной системы, раздражение воспринимают всей клеткой и способны отвечать на них движением - таксисом, в связи с чем, эти биообъекты и их реакции можно рассматривать в качестве диагностических тестовых систем для выявления токсичности тестируемых веществ [3].

При выборе тест-организма необходимо учитывать чувствительность и резистентность к токсическому действию. Чувствительность определяется минимальными концентрациями токсических веществ, при влиянии которых можно зарегистрировать ответные реакции организма. Резистентность определяется максимальными концентрациями токсикантов, при наличии которых организм выживает. Таким образом, чувствительность и резистентность показывают диапазон оценки токсичности вещества.

На кафедре биотехнологии Национального фармацевтического университета проводится работа по биотестированию фармацевтических, косметических и биотехнологических препаратов и продуктов на токсичность с использованием как тест–объектов инфузории туфельки Paramecium caudatum [2].

Целью данной работы является получение и накопление чистой культуры Paramecium caudatum и проведение биотестирования, а именно – определение острой токсичности косметических средств.

Метод изучения острой токсичности с использованием биоиндикатора инфузории основан на определении количества погибших и неподвижных клеток в 1% растворе тестируемого препарата.

На первом этапе биотестирования необходимо было получить чистую культуру Paramecium caudatum и накопить достаточное количество инфузорий в 1 мл питательной среды. В качестве корма для инфузорий можно использовать настой сена, высушенные корки банана, тыквы, дыни, нарезную кружочками морковку, гранулы рыбьего комбикорма, молоко, сушеные листья салата, кусочки печенки, дрожжи, водоросли, то есть те субстанции, которые или непосредственно употребляются туфельками (дрожжи, водоросли), или являются субстратами для развития бактерий [3, 4]..

Наиболее простым способом является разведение Paramecium caudatum на снятом, кипяченом или сгущённом (без сахара) молоке: его вносят в культуру (1 - 2 капли на 1 л) один раз в неделю [1].

Для накопления инфузорий использовали питательную среду Лозина – Лозинского.

Кормили инфузории сухими хлебопекарскими дрожжами с периодичностью 7-10 дней. Для этого 40 мг дрожжей помещали в стеклянную мерную колбу с 60 мл суспензии инфузорий, которые находились в среде Лозина-Лозинского. Через 7-10 дней после кормления перед последующим, суспензию инфузорий отмывали от продуктов метаболизма и корма [2]. Отмывание проводили 2-3 раза. После отмывания среда не должна содержать остатки дрожжей (определяют визуально) и должна быть прозрачной. Культивирование особей инфузорий проводили при температуре (20 ± 5) ̊ C. Для анализа использовали культуру Paramecium caudatum в начале стационарной фазы роста. Она наступает на 2-3 сутки. После очистки определяли количество инфузорий в 1 мл питательной среды методом подсчета в камере Горяева. В 1 мл среды должно быть не меньше 5 особей инфузорий. Для проведения биотестирования инфузории должны быть активными. Анализы проводят через 4 дня после кормления и отмывания [2, 3].

Исследуемые препараты разводили до 1% раствора, определяли их рН (рН должен быть в пределах 6,2-7,8 для обеспечения нормальной жизнедеятельности парамеций). После этого 1 мл подготовленного 1% раствора добавляли к 1 мл очищенной питательной среды с инфузориями и проводили микроскопирование. Определяли время полной остановки и гибели 3 особей инфузорий и сравнивали со временем в контрольном растворе. В качестве контрольных растворов токсикантов использовали 13% раствор спирта этилового и 1% раствора перекиси водорода. Показателями токсичности для Paramecium caudatum являются необратимая остановка, изменение формы и лизис парамеций. Если время остановки и гибели инфузорий в исследуемых образцах было больше чем в контроле, то это свидетельствует об отсутствии токсического действия на организм инфузорий, а если наоборот, то подтверждает острую токсичность препарата на организм Paramecium caudatum [2].

Проведенные исследования по биотестированию косметических средств с растительными биологически активными компонентами в составе, показали, что время двигательной активности парамеций более продолжительное: гель (7,17±0,05 мин, 4,82±0,17 мин), гель-маска (7,40±0,13 мин, 5,14±0,04 мин), по сравнению с действием токсикантов: 1% раствор перекиси водовода (5,16±0,06 мин), 13% раствор спирта этилового (2,21±0,04 мин).

Выводы. В результате проведенной работы получили чистую культуру тест-объекта Paramecium caudatum для проведения биотестирования косметических средств на основе фитокомпонентов. Проведенные исследования показали, что анализируемые косметические средства существенно удлиняли период сохранения двигательной активности инфузорий Paramecium caudatum в присутствии токсикантов и не проявляли острой токсичности.

Таким образом, изучение и использование методов определения острой токсичности препаратов с использованием в качестве тест-объектов инфузорий Paramecium caudatum является эффективным и может быть использовано в последующих исследованиях.

Литература

1. Биотестовый анализ - интегральный метод оценки качества окружающей среды: учебно – методическое пособие / А.Г. Губнов [и др.]; под общей редакцией В.И. Гриневича; ГОУ ВПО Иван. гос. хим.–технол. ун-т.-Иваново, 2007. – 112 с.
2. Кудрин А.Н., Ананин В.В., Балабьян В.Ю. Система экспресс-методов интегральной оценки биологической активности индивидуальных и комплексных препаратов на биологических объектах // Рос. хим. журн. - 1997. – №41(5). – С. 114-123.
3. Винаходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: автореф. дис… докт. биол. наук: 03.00.23. – М., 2007. – 40 с.
4. Терехова В.А., Воронина Л.П., Гершкович Д.В. Биотест-системы для задач экологического контроля: Методические рекомендации. - М.: Доброе слово, 2014. – 48 с.