Результаты молекулярно-генетических исследований при болезни паркинсона у лиц узбекской национальности

Резюме

Проведены молекулярно-генетические исследования на образцах ДНК 280 человек, из них с болезнью Паркинсона было 140 больных, больные сосудистым паркинсонизмом составили 60 человек и 80 человек составили группу контроля. Исследованы мутации генов PARK1, PARK2, LRRK2, «нулевые» полиморфизмы генов детоксикации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1. Выявлено отсутствие мутации T240M в гене PARK2 в исследуемой выборке, мутация Ala53Thr в гене PARK1 выявлена лишь у одного больного с сосудистым паркинсонизмом. Суммарная частота мутации LRRK2-G2019S составила 5,5% в общей группе обследованных пациентов с БП, 5,7% среди больных со спорадической формой БП и 17,6% среди аутосомно-доминантных случаев заболевания. Проведены гено-фенотипические сопоставления.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, молекулярно-генетические исследования

Болезнь Паркинсона встречается повсеместно, частота встречаемости её составляет, по последним данным, от 31,4 (в Ливии) до 328 (в Индии) на 100000 населения, резко увеличиваясь с возрастом. В возрастной группе старше 60 лет данное заболевание встречается у 1–2% лиц, среди населения старше 75 лет у 3% и выше, что делает болезнь Паркинсона вторым по распространенности нейродегенеративным заболеванием после болезни Альцгеймера [2, 3, 5, 10].

Согласно современным представлениям, около 5–10% всех случаев БП имеют прямую наследственную моногенную основу, тогда как абсолютное большинство пациентов представлены спорадической формой БП мультифакториальной природы [Иллариошкин С.Н., 2011]. В развитии спорадической формы БП имеет значение специфическое взаимодействие генетических и средовых факторов, определяющих особенности клеточной детоксикации и обмена ксенобиотиков, антиоксидантной защиты, процессинга ряда нейрональных белков, дофаминового обмена [1, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14].

В настоящее время назрела необходимость скрининга больших групп здоровых лиц на предмет носительства изоформ генов-кандидатов паркинсонизма и выявления аллелей риска. Это играет важную роль в проведении определенных профилактических мер, включающих специальную диету, отказ от приёма определенных препаратов, исключение занятости на вредном производстве, отказ от занятия определенными видами спорта (в частности боксом), обязательная медикаментозная и физиотерапевтическая профилактика; что может значительным образом отсрочить, замедлить прогрессирование или не дать развиться паркинсонизму вовсе.

За последние годы накоплено значительное число данных о вовлеченности различных полиморфных генов в патогенез БП (Иллариошкин С.Н, 2014). Однако, несмотря на значительные успехи, достигнутые в данной области, по-прежнему, дискутабельными являются данные по частоте встречаемости и вовлеченности мутаций различных генов в патогенез БП.

Цель исследования: изучить роль мутаций генов PARK1, PARK2, LRRK2 в предрасположенности к развитию болезни Паркинсона и характера клинического течения заболевания.

Материал и методы исследования: Молекулярно-генетические исследования проведены на образцах ДНК 280 человек, из них с болезнью Паркинсона было 140 больных, больные сосудистым паркинсонизмом составили 60 человек и 80 человек составили группу контроля. Все обследованные лица были лицами узбекской национальности по обеим родительским линиям и происходили из семей, проживавших на протяжении 3 поколений на территории Узбекистана.

Молекулярно-генетические исследования проводились в Центре геномных технологий (ЦГТ) при Институте Генетики и Экспериментальной Биологии Растений (ИГиЭБР) Академии Наук Республики Узбекистан (АН РУз) и Центре Медицинской Генетики Института Биохимии АН РУз (под руководством проф. Р.С. Мухамедова).

Выделение ДНК. Материалом для ДНК служила венозная кровь из локтевой вены объемом 1 мл. Для сбора, хранения и транспортировки крови использовались вакьютейнеры или одноразовые пластиковые пробирки с антикоагулянтом- консерватором объемом 0,5 мл. Кровь для дальнейшей обработки хранилась при температуре не выше +4 °С.

Выделение ДНК из цельной крови осуществлялось набором реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (производство ООО “Лаборатория ИзоГен”, Москва, Россия). Данный набор реагентов основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дербиса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™ - сорбенте. ДНК, элюированная из сорбента ЭкстаГеном E™ или чистой водой напрямую использовалась для дальнейшего проведения анализа. Выделение ДНК проводилось по стандартному протоколу выделения ДНК с использованием набора реагентов Diatom™ DNA Prep 200.

Проведение ПЦР – амплификации. Супернатант с ДНК далее подвергался непосредственно генотипированию путем ПЦР-амплификации.

ПЦР анализ проводили с использованием набора реагентов для ПЦР амплификации ДНК GenePak™ PCR Core (производство ООО “Лаборатория ИзоГен”, Москва, Россия). Использовались готовые для амплификации пробирки Master Mix, которые содержат в лиофилизированном сухом состоянии ингибированную “для горячего старта” Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозодтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 u, 200 мкМ и 2,5 mM, а также опримизированную буферную систему для проведения стандартной ПЦР амплификации. В пробирки Master Mix добавлялось по 5 мкл смеси праймеров, с конечной концентрацией 0.5 мкМ, 10 мкл ПЦР растворителя и по 5 мкл исследуемой ДНК. Для проведения ПЦР амплификации использовали GeneAmp® ПЦР систему 9700 с золотым 96-ячеечным блоком (Applied Biosystems).

Типирование образцов ДНК по гену PARK1 проводили с праймерами F: 5’- gctaatcagcaatttaaggctag-3’ и R:5-gatatgttcttagatgctcag-3’; по гену PARK2 с праймерами F: 5’-tag agg aaa aat gag ccg gga tc-3’ и R: 5’-cta ttt tta gat cct tac ctg acc tct gtg c-3’; по гену LRRK2 –F: 5'-tn-tga-tgc-ttg- aca-tag-tgg-ac-3^’ и R: 5'-cac-atc-tga-ggt-cag-tgg-tta-tc-3';

Проведение ПДРФ анализа

Так как большинство из анализируемых нами мутаций представляет собой точечную нуклеотидную замену, для её верификации необходим так называемый ПДРФ-анализ – анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis). Для анализа выбранных нами мутаций использованы следующие рестриктазы:

1. Tsp45I – для определения Ala53Thr мутации в гене PARK1;
2. HpyCH4IV – для детекции T240M мутации в гене PARK2;
3. BstSFI – для определения мутации G2019S в гене LRRK2.

Осуществлялись визуализация и фотодокументация результатов ПЦР - амплификации.

ПЦР-продукты амплификации фракционировали в 2-3% агарозном геле в течение 60-90 мин. при напряжении 100-120 В, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью стандартных методов вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для оценки достоверности различий с использованием программы Excel – 2007 и BioStat 2007. Средние величины представлены в виде Мm (средняя величинасредняя ошибка средней). Основой статистической обработки был Х2-анализ четырехпольных таблиц распределения генотипов в изучаемой группе и контроле. В качестве порога уровня значимости был выбран стандартный уровень Р=0,05 (5%). Для каждого генотипа вычисляли отношение шансов ОR, характеризующее риск заболевания, и соответствующий 95% доверительный интервал.

Результаты исследования и их обсуждение: В настоящей работе нашей целью был поиск мутации Ala53Thr в гене PARK1 – мультипликации, которые были выявлены в определенной части семейных случаев БП.

Данная мутация в исследуемой выборке больных наблюдалась нами лишь у одного больного с сосудистым паркинсонизмом, акинетико-ригидной формой и ранними когнитивными нарушениями, во всех остальных случаях наблюдается отсутствие данной мутации гена PARK1. Полученные нами данные схожи с результатами исследований многих авторов и указывают на то, что первичные синуклеинопатии не характерны для лиц узбекской национальности.

Анализ мутации T240M гена PARK2

В патогенезе болезни Паркинсона лежат комформационные изменения, зачастую связанные с мутациями в гене паркина (PARK2). Предполагается роль гетерозиготности по мутациям в гене паркина в развитии заболевания в позднем возрасте, в то время как гомозиготность по этим мутациям является причиной развития заболевания в молодом возрасте (Foroud T. et al 2003). Анализ литературных данных показал, что выявлено около 10-ти устойчивых мутаций в гене PARK2, распространенность которых значительно варьирует в различных популяциях. Lucking et al., 2000, при анализе литературных данных относительно мутации T240M, делает вывод, что её гомозиготные варианты лежат в основе развития аутосомно-рецессивного ювенильного (юношеского) паркинсонизма, однако, в исследовании Mata et al., 2004 показан повышенный риск развития спорадической формы БП у носителей мутаций T240M гена PRKN2 в гетерозиготном состоянии.

Нами был проведен ПДРФ-анализ мутации T240M в гене PARK2 у всех пациентов. По результатам этих анализов гена PARK2, в исследуемой выборке наблюдается отсутствие данной мутации у всех пациентов, как в группе с БП, так и с сосудистым паркинсонизмом, а также в контрольной группе.

1 2

Анализ мутации G2019S в гене LRRK2

Мажорная мутация G2019S в гене LRRK2 (локус PARK8) –нуклеотидная замена 6055G>A в 41-м экзоне LRRK2, ведет к замещению глицина (G) на серин (S) в белковой позиции 2019, встречается по данным разных авторов с частотой от 0,4-10% до 40% и имеет связь с наличием или отсутствием семейного анамнеза [158, 160]. Нами был предпринят поиск мутации G2019S в гене LRRK2 у 200 больных с паркинсонизмом (140 пациентов с БП и 60 пациентов с СП).

При обследовании пациентов в указанной выше выборке были выявлены случаи гетерозиготного носительства мутации G2019S в гене LRRK2. Всего было выявлено из 200 больных БП и СП– 11 случаев (5,5%) гетерозиготного носительства мутации G2019S в гене LRRK2. Из них лишь 1 носитель данной мутации страдал сосудистым паркинсонизмом, остальные 10 пациентов страдали болезнью Паркинсона. Cемеро носителей G2019S мутации не имели семейного анамнеза, а три были членами семей с четким аутосомно-доминантным наследованием БП. Таким образом, частота данной мутации при БП составила 7,1% (5,7% среди больных со спорадической формой БП и 17,6% среди наследственных форм заболевания). В контрольной группе мутация G2019S в гене LRRK2 не выявлена.

1 3

Таблица 1 -Частота встречаемости мутации G2019S гена LRRK2 среди пациентов с болезнью Паркинсона и в контрольной группе в различных популяциях мира

1 4

Мы провели сопоставления между полученными нами результатами и данными мировой статистики по частоте встречаемости данной мутации при болезни Паркинсона (Lancet Neurol., 2008) среди 24 популяций мира (табл. 1.). Данные сопоставления показали, что частота встречаемости мутации G2019S гена LRRK2 при болезни Паркинсона у лиц узбекской национальности (5,7% среди спорадических и 17,6% среди наследственных форм БП) приближены к частоте мутации среди португальцев (4% и 14% соответственно), намного ниже, чем среди арабов Северной Африки (39% и 36%), евреев-Ашкенази (10% и 28%), однако, намного выше чем у европейской популяции.

По литературным данным, у пациентов с БП, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2, имеется ряд клинических особенностей заболевания: относительно позднее начало, первым признаком болезни чаще был тремор и, как правило, хороший эффект при лечении Л-ДОФА- содержащими препаратами (Berg D. et all., 2005; Шадрина М. И. и др., 2007). Кроме того, описано, что у носителей данной мутации и в гетерозиготном, и в гомозиготном состоянии клиническая картина заболевания и возраст начала БП не отличаются (Lesage S. et al., 2005; Paisan-Ruiz C. et al., 2005).

Мы провели анализ клинических данных и течения болезни Паркинсона у носителей мутации G2019S в гене LRRK2, и сопоставили их с данными больных без выявленных мутаций (табл. 2).

Таблица 2 - Сопоставление клинических признаков больных БП с мутацией G2019S и без неё

Примечание: * - достоверные различия между показателями в сравниваемых группах, при р<0,05

Данные сопоставления показали достоверное преобладание в группе больных с мутацией мужчин (p=0,04). Также достоверным было преобладание в данной группе, по сравнению с группой без мутации, смешанной формы заболевания (60% и 31,5% соответственно), тогда как во второй группе отмечается процентное преобладание больных с акинетико-ригидной формой заболевания. Оценка эффективности леводопатерапии, которую получали в первой группе 8 пациентов, а во второй группе -70 пациентов, показала более высокую эффективность её в первой группе (75% против 40% во второй группе). Во второй группе в 24,3% случаев наблюдалось отсутствие эффекта от леводопатерапии, тогда как в группе с мутацией G2019S в гене LRRK2 отсутствие эффекта не отмечалось ни в 1 случае. Однако, в группе больных с обнаруженной мутацией наблюдается в 3 случаях (37,5%) развитие ранних побочных эффектов от леводопатерапии.

В качестве примера приводим следующее клиническое наблюдение:

Больная А., 1975 г.р., поступила в реабилитационный неврологический центр РКБ №1 УзМинЗдрава 25.09.2008 г., с жалобами на дрожь в руках, замедление движений в конечностях, чувство скованности, стягивания в межлопаточной области, изменение речи.

Анамнез заболевания: Считает себя больной в течение 4-х лет, заболевание началось после стресса-смерть отца, с дрожи в правой руке, затем присоединилась скованность в руке, через год

присоединилось замедление при ходьбе, ещё через год появилась дрожь в левой руке, замедление речи.

До поступления к нам диагноз не установлен, противопаркинсонического лечения не получала.

Анамнез жизни: Мать пациентки умерла в молодом возрасте при родах, отец в возрасте 53-х лет от инфаркта миокарда. Работала кондитером в частной кондитерской, имела продолжительный профессиональный контакт с ароматизаторами и пищевыми красителями.

Объективно: Общее состояние относительно удовлетворительное. Кожные покровы чистые. Лимфоузлы не увеличены. Костно-мышечная система: без деформаций. В легких везикулярное дыхание. Тоны сердца ясные, ритмичные, пульс 78 уд в мин. АД 110/70 мм.рт.ст. Язык влажный, чистый. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не пальпируются. Стул регулярный. Симптом Пастернацкого (-) с двух сторон, мочеиспускание свободное, отеков нет.

Неврологический статус: Глазные щели равновеликие D = S. Движение глазных яблок в полном объеме. Нистагма нет. Гипомимия. Гипофония, смазанность речи. Парезов и параличей нет. Мышечный тонус повышен во всех конечностях по пластическому типу, S<D. Симптом зубчатого колеса в обоих локтевых и лучезапястных суставах S<D. Замедление и снижение амплитуды движений в конечностях при проведении двигательных тестов, S<D. Наблюдается тремор покоя в обеих руках, S<D. Двусторонний ахейрокинез, походка изменена, мелкими шагами, полусогнутая спина. Сухожильные рефлексы вызываются с BR-TR, с PR-AR S=D. В позе Ромберга устойчива. Координаторные пробы выполняет без атаксии. Менингеальных и патологических симптомов нет. Ортостатической гипотензии нет. Субклинически выраженные депрессия (8 баллов) и тревожность (10 баллов).Когнитивная функция не нарушена, MMSE-29 баллов.

Данные лабораторно-инструментальных исследований:

Анализ крови:Гемоглобин –145, эр-4,5, ЦП –0,9, лейкоциты – 7,8, палочкоядерные-1,

сегментоядерные–78, мон- 4, СОЭ-12

Биохимия крови: общий билирубин-9,7мг%, несвязанный-авс, связанный-9,7, мочевина 7,9, креатинин-159,1, сахар крови: 5,2 ммоль/л.

Коагулограмма: ПТИ-95%, Фибриноген А- 2,4,

Анализ мочи: уд вес –1010 ,белок - авс, лейкоциты 1-3, эпителий-4-8, оксалаты +, бактерии +

ЭКГ: Синусовая аритмия. ЧСС 67-76 в мин. Нормальное положение ЭОС. Признаки нарушения внутрипредсердной проводимости.

РЭГ: КБ (FM) кровоток сохранен, тонус сосудистой стенки по типу смешанной дистонии.

Триплексное сканирование экстракраниальных отделов брахиоцефальных сосудов: сонные и позвоночные артерии проходимы, ход сосудов ровный. Аномалия впадения правой позвоночной артерии в канал поперечных отростков на уровне С5. Кровоток по обеим позвоночным артериям увеличен, нормотоничный. Нарушений оттока не обнаружено.

МРТ головного мозга: расширение конвекситальных субарахноидальных пространств в лобных, височных и теменных областях с двух сторон. Сигнал в Т2 от подкорковых структур не изменен.

1 6

Клинический диагноз: Болезнь Паркинсона, смешанная форма, II стадия по Хен и Яру.

Сопутствующая патология: Эндоцервицит.

Проведен молекулярно-генетический анализ по поиску исследуемых мутаций. В результате проведенных исследований выявлено, что больная является гетерозиготой по мутации G2019S гена LRRK2.

Лечение: Луцетам 10мл в/в, Наком 250 мг по ½ таб 2 раза в день, ПК-Мерц -500,0 в/в капельно №6, Актовегин 5,0 в/в стр, таб Антипресс по 1 таб. утром, глюкоза 5%-100,0+аскорбиновая кислота 5%-5,0 в/в капельно.

Физиотерапия.

На фоне проводимой терапии, впервые начаты прием накома, вливания ПК-Мерца, с последующим приемом таблеток ПК-Мерц, отмечается выраженная положительная динамика: снижение мышечного тонуса, уменьшение скованности, уменьшение тремора, улучшение походки. В течение 1 года пациентка в качестве противопаркинсонической терапии принимала наком по 1/2 таб 3 раза в день, на фоне данного лечения больная чувствовала себя удовлетворительно, самостоятельно ходила, дрожь была незначительной. Через 1,5 года в связи с появлением дискинезий, к лечению добавлены таблетки ПК-Мерц 100 мг 1 таб 2 раза в день, который показал положительный эффект в виде купирования дискинезий пика дозы, улучшения двигательной активности.

Больная находится под нашим наблюдением и по настоящее время, получала в нашей клинике неоднократное амбулаторное и стационарное лечение.

Клинической особенностью данного случая является раннее начало заболевания (30 лет), клиническая картина смешанной формы заболевания, выраженный положительный ответ на леводопатерапию, однако повлекшее и раннее развитие лекарственных дискинезий.

Таким образом, нами впервые выявлено, что мутация G2019S гена LRRK2 является важной составной частью генетической структуры подверженности лиц узбекской национальности к развитию болезни Паркинсона.

Идентификация мутаций в гене LRRK2 в определенной части случаев болезни Паркинсона, в том числе у лиц без четкого семейного анамнеза, имеет большое значение для медико-генетического консультирования.

Заключение: Таким образом, по результатам молекулярно-генетического исследования можно сделать следующие выводы:

Мутации Ala53Thr в гене PARK1 и T240M/T240R в гене PARK2 не являются факторами риска развития болезни Паркинсона и сосудистого паркинсонизма у лиц узбекской национальности.

Частота мутации G2019S в гене LRRK2 составила 7,1% в общей группе обследованных пациентов с БП, 5,7% - среди больных со спорадической формой БП и 17,6% - среди аутосомнодоминантных случаев заболевания.

Мутация G2019S в гене LRRK2 ассоциирована со смешанной формой заболевания, с высокой эффективностью леводопатерапии.

Список литературы

1. Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А, Шандрина М.И. и др. Гетерогенность спорадической болезни Паркинсона: молекулярный подход к решению проблемы // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. ‒ Москва, 2007. ‒ Том 1. ‒ № 1. ‒ С.23-30
2. Левин О.С., Шиндряева Н.Н., Докадина Л.В. Клиническая эпидемиология болезни Паркинсона // Экстрапирамидные расстройства: вчера, сегодня, завтра, сборник статей под редакцией Левина О.С. ‒ Москва, 2013. ‒стр. 41-52.
3. Левин О.С., Росинская А.В. Диагностика и лечение ранней стадии болезни Паркинсона//Сборник материалов III Национального конгресса по болезни Паркинсона и расстройствам движений.‒Москва, 2014.‒C.56‒61.
4. Мизуно Й. Механизмы развития и прогрессирования болезни Паркинсона // Болезни движений: медицинские и социальные аспекты ‒ Москва, 2010. ‒ С. 49-56.
5. Похабов Д.В., Абрамов В.Г., Нестерова Ю.В. Эпидемиология паркинсонизма (поматериалам  регистра в Красноярском крае) // Сборник I Национального конгресса по болезни Паркинсона и расстройствам движений. ‒ Москва, 2008. ‒ С. 20-27
6. Пчелина, С.Н. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Медицинская генетика. ‒ Москва, 2006. ‒ Т.5 ‒ №2. ‒ С. 48-51.
7. Ревазова Ю.А.,Аксенова М.Г.,Сидорова И.Е., Григорьева С.А. Изучение индивидуальной чувствительности человека к действию факторов окружающей среды молекулярно‒генетическими методами// Неинвазивные методы в оценке здоровья населения. Москва, 2006. гл.17. ‒ С 274-286
8. Страчунская Е.Я. Эпидемиология паркинсонизма // Вестник Российской академии естественных наук. ‒ Санкт-Петербург, 2006. ‒ №1. ‒ С. 86-91.
9. Якимовский А.В., Пушнова Е.А., Ахмедова С.Н., Автономов В.В. Молекулярно генетические и токсико-экологические основы этиологии и патогенеза болезни Паркинсона (паркинсонизма). // Журнал невропатологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. ‒ Москва, 1997. ‒ №4. ‒ С.69-73.
10. Behari M, Srivastava AK, Das RR, Pandey RM. Risk factors of Parkinson's disease in Indian patients. // J Neurol Sci. ‒ 2001. ‒ Vol. 15; 190 (1-2). ‒ Р. 49-55.
11. Chen H, Huang X, Guo X. et al. Smoking duration, intensity, and risk of Parkinson disease. //Neurology. ‒ 2010. ‒ Vol. 74. ‒ Р. 878-884.
12. Coppedè F. Genetics and epigenetics of Parkinson's disease. // Scientific World Journal. ‒ 2012. ‒ Р. 489-492.
13. De Rosa P., Marini ES., Gelmetti V., Valente EM. Candidate genes for Parkinson disease:Lessons from pathogenesis // Clin Chim Acta. ‒ Netherlands, 2015. ‒ Vol. 20; 449. ‒ Р. 68-76.
14. Nalls MA., Keller MF., Hernandez DG., Chen L., Stone DJ., Singleton AB. Parkinson'sProgression Marker Initiative (PPMI) investigators. Baseline genetic associations in the Parkinson's Progression Markers Initiative (PPMI) // Mov Disord., United States, 2016. ‒ Vol. 31(1). ‒ Р. 79-85.