Введение
В целях совершенствования использования ресурсов лекарственных растений Южного региона, необходимо применить меры к внедрению современных технологий, ориентированных на выпуск экологически чистой продукции с высокими потребительскими качествами. Одной из таких технологий является использование культур клеток и тканей растений invitro.
Алкалоидоносные растения широко распространены по территории Казахстана и могут служить сырьевой базой для получения лекарственных средств и фитопрепаратов самого различного назначения.
Преимуществом создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущим или выращиваемые на плантациях растения) является: получение продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий и возможность культивирования клеток растений, оптимизация и стандартизация условий выращивания.
В последние годы культивирование клеток и тканей растений находит все более широкое применение в биотехнологии, однако технологии получения каллуса гармалы обыкновенной, обладающей способностью продуцировать биологически активные вещества (БАВ), которые могут быть использованы в медицине и фармацевтической промышленности, на настоящее время практически не изучены.
В связи с этим большое практическое значение имеет получение алкалоидов из клеточной ткани PeganumharmalaL.
Гармалаобыкновенная (PeganumharmalaL.) - многолетнее травянистое растение из семейства
Парнолистниковые, широко распространена во всех республиках Средней Азии и в южном Казахстане, часто встречается также в сухих степях в южных районах европейской части СНГ и на Кавказе. Источник ценных биологически активных веществ, в том числе фармакологически значимых алкалоидов. Из суммы алкалоидов сначала выделены в чистом виде гармалин, гармин (банистерин), гармалол и L-пеганин (вазицин), а в последние годы - пегамин, пеганол, дезоксипеганин (всего 17 оснований). Алкалоиды гармалывоздействуют на сердечно-сосудистую систему, органы дыхания и пищеварения, на чувствительность нервных окончаний, тонус мускулатуры. Поэтому благодаря своей физиологической активности многие алкалоиды, будучи сильными ядами, находят применение в медицине.
Целью данной работы является изучение влияния условий культивирования культуры
клетокРедапитһагтаІа L. нанакопление алкалоидов.
Материалы и методы исследования
При выполнении работы объектами исследования служили интактное растениеPeganumharmalaL., собранное в полузасушливых степях ЮКО, и инициированная из него каллусная ткань, выращенная на модифицированной питательной среде MurashigeandSkoog. Для стерилизации эксплантов применяли растворы диацида, 0,1 % раствор KMnO4, 70 % раствор этанола + 10 % раствор гипохлорита натрия (1:1), 10 % раствор пероксида водород и 96% этиловый спирт. Стерилизацию проводили в чашках Петри, после чего семена помещали для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды в термостат при температуре 28 - 300С. Использовали питательные среды со стандартным минеральным составом по Мурасиге-Скуга, Уайта и Гамборга, куда вводили культуру invitro. Для оценки роста каллусной культуры применяли весовой метод, взвешивая на аналитических весах извлеченный из пробирки пинцетом каллус. Измерения производились каждые 4 дня. Изъятие ткани для анализа проводили на 40-е сутки культивирования. Жизнеспособность культуры определяли соотношением количества жизнеспособных клеток к общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителем метиловым синим.
Результаты и обсуждение
Как показали результаты предварительных опытов, наилучшим материалом для введения в культуру іпуіігоявляются молодые побеги и проростки, полученные из семян. Для стерилизации семян и эксплантов наиболее приемлемым оказалось стерилизация 96 %-й этиловым спиртом и 0,1 %-й раствором KMnO4 в течение 1 мин. и 20 мин. соответственно. При этом достигался наиболее высокий процент живых, незаряженных эксплантов.
Растения, культивируемые на среде с минеральным составом по MurashigeandSkoog, показали наиболее высокий процент жизнеспособности, чем на средах Uata и Гамборга.Каллусная ткань была получена в результате каллусогенеза из молодых побегов на среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей нафтилуксусную кислоту (НУК) и 6-бензиламинпурин (БАП) в составе 0,4- 0,8 мг/л и 0,2 -0,4 мг/л при пониженной концентрации сахарозы.
Динамика роста каллусной ткани в зависимости от продолжительности культивирования приведена на рисунке 1.
Из рисунка 1 видно, что оптимальное время культивирования для накопления массы каллусной ткани Peganumharmala L. на среде MurashigeandSkoog составило 30 суток. Известно, что большое влияние на накопление продуктов вторичного метаболизма в условиях invitro оказывает способ культивирования растительной ткани. Для выяснения влияния способов культивирования на процессы роста клеточной ткани Peganumharmala L. была исследована динамика роста при поверхностном культивировании на агаре и инертном носителе с периодическимомыванием ткани питательной средой.Выбор пенополиуретана в качестве инертного носителя для выращивания тканей Peganumharmala L. был обусловлен существенными преимуществами этого материала. Это дешевизна, удобство манипулирования, возможность многократного использования носителя. Пористость этого материала обусловливает хороший доступ веществ питательной среды к клеткам.На рисунке 2 приведена динамика роста каллусной ткани Peganumharmala L. при культивировании на пенополиуретановых подложках и агаре.
По структуре каллусная ткань на пенополиуретане не отличалась от каллусной ткани получаемой на агаре. На пенополиуретане наблюдался более интенсивный рост, чем на агаре, и масса каллусной ткани на пенополиуретане превышала в два раза по сравнению с агаром, уже начиная на 12-е сутки культивирования. На 30-е сутки масса каллусной ткани полученной на пенополиуретане составила более 11 г/л, тогда как на агаре масса каллуса за этот же период культивирования достигала более 7 г/л.
Пенополиуретановые пластины можно рассматривать как химически нейтральную поддерживающую основу, позволяющую отказаться от использования агара, что удешевляет процесс.
На рисунке 3 представлена динамика накопления алкалоидов в культуре клеток Peganumharmala L. в зависимости от способа культивирования.
Установлено, что при выращивании каллусной ткани на пенополиуретановых подложках накопление алкалоидов происходило раньше, чем при культивировании на агаре. На 30-е сутки содержание алкалоидов в каллусной ткани культивированной на пенополиуретане составляло 1,2 раза больше, чем на агаре. Для применения в фармацевтической промышленности с практической точки зрения представляет интерес каллусная ткань, культивируемая на пенополиуретане, с использованием модифицированной питательной среды MurashigeandSkoog.
В следующей серии экспериментов определяли содержание алкалоидов в каллусной ткани Peganumharmala L. Было обнаружено, что между интенсивностью роста каллусной ткани и синтезом алкалоидов существует прямая зависимость. На рисунке 4 приведено содержание алкалоидов в каллусной ткани Peganumharmala L.b зависимости от продолжительности культивирования.
Из рисунка 4 видно, что оптимальное время культивирования для Peganumharmala L. с целью получения наибольшего количество алкалоидов (4,20 %) составляет также 30 сут.
Выводы. Таким образом, на основании результатов, полученных при проведении экспериментов, были сделаны следующие выводы:
- Наилучшим материалом для введения в культуру іпуіігоявляются молодые побеги и проростки, полученные из семянРедапитНагтаІаЬ.
- Модифицированная питательная среда с минеральной основой по MurashigeandSkoog наилучшим образом обеспечивает процессы жизнедеятельности эксплантов Peganumharmala L. и накопление биологически активных веществ в каллусной ткани.
- Установлено, что гормональный состав среды влияет на накопление клеточной биомассы Peganumharmala L. и количество алкалоидов в ней.
- Наибольшее количество алкалоидов (4,20 %) содержится в каллусной ткани, выращенной при продолжительности культивирования 30 сут.
Таким образом, каллусная ткань гармалы является перспективным источником биологически активных веществ и представляет большой потенциал для их синтеза.
ЛИТЕРАТУРА
- Лазурьевский Г.В. Терентьева И.В. Алкалоиды и растения. - Кишинев: Штиинца, 1995. - 150 с.
- Гринкевич Н.И. Лекарственные растения.-М.: Высшаяшкола,1991.- 420 с.
- Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. plant.,1998. - V. 15.- №13.- Р. 473-497.
- Семенов С.М. Лабораторные среды для растительных эксплантов. - М.: Агропромиздат, 2005.-25с.
- Плынская Ж.А., Величко Н.А. Влияние регуляторов роста на процессы синтеза вторичных веществ в культуре invitroEphedramonosperma // Химия растительного сырья. - 2008, №4. - С. 125-127.