Поиск перспективного лекарственного растительного сырья среди видов рода trifoliuml.

Резюме

Впервые определено количественное содержание пинитола и сахаров в 7 видах клевера, произрастающих в Узбекистане. Наибольшее содержание пинитола отмечено в клевере луговом. Также показано, что по содержанию пинитола наиболее привлекательна надземная часть растения, которая была рекомендована в последующем для использования в медицинской практике.

Ключевые слова: виды клевера, хроматография, пинитол, сахара, количественное определение.

Цель работы. Известно, что из клевера зарубежными учеными выделен (+)-пинитол [1], и установлено, что это вещество обладает широким спектром физиологической активности, в частности, в США пинитол запатентован в качестве антидиабетического лекарственного средства [2].

Учитывая отмеченные обстоятельства, а также широкое распространение данного растения на территории нашей республике, популярностью растения в народной медицине, нами исследованы все 7 видов клевера, произрастающих в Узбекистане, на содержание этого соединения и осуществлен поиск перспективного вида для разработкиэффективных пинитол содержащих лекарственных средств.

Материалы и методы исследования.Объектом исследования служили травы 7 видов клевера, заготовленных в период цветения с ботанически достоверных растений в различных регионах Узбекистана. Это клевер земляничный (T. fragiferum L.), полевой (T. campestre Schreb.), опрокинутый (T. resupinatum L.), ползучий (T. repens L.) и луговой (T. pratense L.).

Качественную оценку растений на содержание пинитола в лабораторных условиях проводили по разработанной нами методики с помощью метода распределительной хроматографии в тонких слоях сорбента. Для определения пинитола приготавливали растворы рабочего стандартного образца (РСО) и водные извлечения из исследуемых образцов сырья.

Приготовление раствора РСО. 3 мг (точная навеска) лабораторного стандарта пинитола растворяли в 2,5 мл очищенной воды при нагревании на кипящей водяной бане. После полного растворения навески объем раствора доводили до 10 мл метанолом. Раствор использовали после центрифугирования (10 тыс об/мин, 2 мин) или фильтрования через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Получение исследуемого извлечения. Образцы сырья в количестве 2г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм, заливали 20 мл очищенной воды, кипятили в течение 20 мин и фильтровали.

Идентификация пинитола. Исследуемое извлечение и РСО по 20 мкл по отдельности вводили в инжектор хроматографа. С помощью капилляра полученное извлечение наносили на линию старта хроматографической пластинки «SilufolUV-254» на расстоянии 1,5 см от края. Рядом, на расстоянии 1,5 см на стартовую линию наносили таким же образом раствор РСО пинитола. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей этилацетат-метанол (3:2). Когда фронт растворителя доходил до края хроматографической пластинки, ее вынимали, высушивали в вытяжном шкафу в течение 2 мин и проявляли концентрированной серной кислотой. При этом обнаруживалось пятно красновато-коричневого цвета cRf 0,60, соответствующее стандартному образцу пинитола [3].

Для количественного определения пинитола в указанных объектах использовали разработанную нами методику с использованием метода ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100.

Детектирование осуществляли с помощью программируемого с рефрактометрического детектора на нормально-фазовой колонке Ultrasphere-amino размером 25 x0,46 см(Весктап,США) при комнатной температуре.

В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды в соотнощении 75:25, предварительно дегазированную и профильтрованную через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Скорость подачи элюента составляла 1 мл/мин, продолжительность анализа 20 мин.

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 2 мм. Около 2 г (точная навеска) воздушно-сухого измельченного сырья (размер частиц 2 мм помещали в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляли воду в соотношении 1:10 и экстрагировали на кипящей водяной бане в течение 15-20 мин. Затем извлечение фильтровали и количественно переносили в центрифужный мерный стакан и центрифугировали со скоростью 3 тыс об/мин в течение 5 мин. Для анализа отбирали часть супернатанта и фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,22 мкм[3].

Хроматограммы исследуемых извлечений проводили путем сопоставления времени их удерживания с временем удерживания стандартных компонентов.

На рисунке 1 приведены хроматограммы содержания пинитола и сахаров в траве 7 видов клевера отечественной флоры.

Идентификация пинитола осуществлялась одновременно с индентификацией сахаров. Это объясняется близостью метаболического происхождения, физических и хроматографических их свойств.

4

Таблица 1

Количественное

пинитола и

в видах

2017ж

где S исп - площадь пика пинитола (сахаров) на хроматограмме раствора испытуемого образца; S ст - площадь пика пинитола (сахаров) на хроматограмме раствора рабочего стандартного образца; Cст - содержание пинитола в растворе рабочего стандартного образца, мг/мл; V- объем суспензии испытуемого образца, мл; m- масса испытуемого образца, мг.

Результаты расчета приведены в таблице1.

Из данных таблицы 1 видно, чтонаибольшее содержание рамнозы - в траве T.neglectum C., фруктозы - в Txampestrc S., а сахарозы, глюкозы, арабинозы и маннозы - в T.resupenatum L. Арабинозу и маннозу содержит и трава T.lappaceumL., но в меньшем количестве, чем T.resupenatumL.

В траве T.pratenseL. содержание глюкозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы меньше, чем в других видах, а по количеству пинитола превосходит все другие виды клевера.

5

По мере убывания количественного содержания пинитола, (в %), виды клевера отечественной флоры можно расположить в следующей последовательности: T.pratense L. > T.neglectum C. > Tfragiferum L. > T.repens L. > T.resupenatum L. > Txampestre S. > T.lappaceum L.

Учитывая вышеизложенное, нами клевер луговой отобран как перспективное пинитол содержащее лекарственное растительное сырье [4].

С целью внедрения клевера лугового в медицинскую практику нами были продолжены исследования.

Объектом исследования служили корни и семена растения. Содержание пинитола в сырье также определили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100.

Результаты и обсуждение.Результаты количественное содержание пинитола в траве клевера лугового, полученные нами раннее (таблица 1) сопоставимы с полученными данными, приведенных в таблице 2.

Из таблице 2 следует, что по содержанию пинитола сырьё морфологических групп клевера лугового можно расположить следующим образом: надземная часть > семена > корни.

Таким образом, научный поиск перспективного источника пинитола среди видов рода TrifoliumL. позволил установить, что это клевер луговой. Дальнейшие результаты исследований показали, что в надземной части клевера лугового содержится большее количество пинитола, чем в корнях и семенах.

Выводы. Впервые определено количественное содержание пинитола и сахаров в отечественных видах клевера. Наибольшее содержания пинитола отмечено в траве клевера лугового, что было учтено при разработке новых лекарственных средств на основе изучаемых видов сырья. Показано, что по содержанию пинитола наиболее привлекательна надземная часть растения, которая была рекомендована в последующем для использования в медицинской практике.

Литература

1. Дренин А.А. Флавоноиды и изофлавоноиды трех видов растений рода TrifoliumL. и ViciaL.: Автореф. дис. ...канд. хим. наук. - Сургут: Медицина, 2008. - 64 с.
2. Richard E., William R. Pinitol and derivatives thereof for the treatment of metabolic disorders // United States Patent. USA, Oct.27, 1998, Pat. No. 5827896.
3. Халилова Ш.Р., Урманова Ф.Ф. Стандартизация травы клевера лугового, произрастающего в Узбекистане // Фармацевтический журнал. - Ташкент, 2013. - № 4.-С.33-38.
4. Халилова Ш.Р. Антидиабетическое средство из сухого экстракта клевера лугового /Патент на изобретение № IAP 05095. // Агентство по интеллектуальной собственности Республики Узбекистан.Зарегистрирован в государственном реестре изобретений Республики Узбекистан. -Ташкент, 25.09.2015 г. - 6 с.