Состояние свертывающей системы крови под действием препаратов глюкозамина и ацетилсалициловой кислоты в условиях локальной холодовой травмы

Аннотация

Целью исследования является выяснение влияния фригопротекторовацетилсалициловойкислоты (АСК) (25 мг/кг) («Bayer», Германия), «Глюкозамина-С БХФЗ» (82,5 мг/кг) (Украина) и субстанции глюкозамина гидрохлорида (Г г/х) (50мг/кг) (Sigma-Aldrich, Германия) на площадь повреждений кожи, динамику массы тела и систему свертывания крови при экспериментальном отморожении у крыс на 3 и 10 сутки исследования.В работе проведен анализ современного состояния проблемы общей и локальнойхолодовой травмы в Украине, представлены ключевые звенья патогенеза отморожений и анализ влияния холодовых воздействий на организм человека. Приведены экспериментальные данные о фригопротекторном действии пищевой добавки «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/хна модели острой холодовой травмы. При острой локальной холодовой травме у крыс наблюдается нарушение свертывающей системы крови. На 3 сутки эксперимента прослеживается динамика восстановления ее показателей в группах, которые до и после локального острого охлаждения получали АСК, «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/х. К 10 суткам после травмы снижается риск тромбообразования и наблюдалось восстановление исследуемых показателей под действием АСК, «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/х. Наиболее выраженное действие на 10 сутки исследования оказывал Г г/х.

Ключевые слова: холодовая травма, глюкозамина гидрохлорид, ацетилсалициловая кислота, система свертывания крови, фригопротекторное действие.

К неблагоприятным факторам окружающей среды, влияющим на жизнедеятельность и работоспособность человека, относят низкую температуру. Холодовая травма возникает как в холодных климатических условиях, так и в зонах с умеренным климатом. Вследствие действия холода возможно, как общее охлаждение, так и локальные повреждения организма (отморожения), которые преобладают по частоте. Патогенез отморожений изучается давно, но остается не выясненным до конца [1-3].

Глубокие отморожения требуют продолжительного и многоэтапного хирургического лечения и часто приводят к тяжелой инвалидизации пострадавших. В Украине в последние годы в связи с ухудшением социально-экономических условий отмечается рост поражений низкими температурами, особенно среди социально незащищенных слоев населения, людей без постоянного места жительства, стариков и детей. Так, в 2006-2007 гг. в Украине было зарегистрировано более 10000 случаев переохлаждений и отморожений. За период 2010-2011 гг. по данным Министерства здравоохранения Украины зарегистрировано более 400 смертельных случаев от переохлаждения, в том числе в Донецкой области - 126, в Запорожской - 53, Волынской - 30, Харьковской - 26, Киевской - 21,

Хмельницкой - 19 [4]. Проблема отморожений особенно актуальна в условиях АТО на Востоке Украины в зоне боевых действий, где холодовая травма в зимний период встречается среди военнослужащих довольно часто.

Холодовая травма требует глубокого изучения, уточнения представлений о патогенезе отморожений, расширения арсенала эффективных лекарственных препаратов [5-7].

В формировании острой ответной реакции на холод вовлекаются все органы и системы. Ключевыми звеньями, обеспечивающими нормальное функционирование организма в условиях холодовой травмы, являются сердечно-сосудистая система и система крови [8-9]. При местных поражениях холодом регистрируются сдвиги свертывающей системы крови и фибринолиза, которые способствуют тромбозам и являются важнейшими звеньями патогенеза отморожений [10].

В наших предыдущих исследованиях установлено, что глюкозамина гидрохлорид (Г г/х) и «Глюкозамин-С БХФЗ», который представляет собой комбинацию глюкозамина гидрохлорида 0,3 г, кислоты аскорбиновой 0,025 г и вспомогательных веществ, проявляют выраженное фригопротекторное действие, снижают степень и скорость агрегации тромбоцитов при экспериментальном остром общем охлаждении [11]. Г г/х в дозе 50 мг/кг значительно увеличивает время жизни животных, двигательную активность, тонус мышц и физическую работоспособность в восстановительном периоде, превосходя ацетилсалициловую кислоту (АСК) [12]. Все эти преимущества обосновывают перспективность изучения Г г/х и содержащих его препаратов как потенциальных фригопротекторов при острой локальной холодовой травме.

Цель исследования: выяснить влияние фригопротекторов АСК («Bayer», Германия), «Глюкозамин-С БХФЗ» (БХФЗ, Украина) и субстанции глюкозамина гидрохлорида (Г г / х) (Sigma- Aldrich, Германия) на площадь повреждений кожи, динамику массы тела как показатель общего состояния организма и систему свертывания крови при экспериментальной острой локальной холодовой травме у крыс.

Материалы и методы. Работа выполнена в весенний период на белых крысах самках массой 210-250 г (65 животных), которых содержали в стандартных условиях вивария НФаУ в соответствии с правилами GLP. Руководствовались Директивой Совета ЕС по вопросам защиты животных, используемых для эксперимента и других научных целей [13].

Контактное отморожение моделировали по методу Бойко В.В. [14] под тиопенталовым наркозом на депилированном участке кожи спины, отступив от позвоночника 1,5 см. Использовали медную пластину размером 3,5 х 3,0 см, которую предварительно охлаждали в жидком азоте ( 196 С⁰), после чего прикладывали к депилированной коже на 3 мин. Этот метод позволяет получить стандартные по площади и глубине холодовые поражения кожи, отвечающие III степени клинической классификации отморожений.

Как интегральный показатель состояния животных после острой локальной травмы использовали массу тела (г) и площадь пораженных участков кожи (см²). Эти показатели измеряли на 1, 3, 5 и 10 сутки после холодового воздействия. Площадь пораженных участков кожи определяли планиметрическим методом в динамике на 1, 3, 5 и 10 сутки.

Исследуемые препараты АСК («Bayer», Германия), «Глюкозамин-С БХФЗ» (Украина), субстанция Г г/х (Sigma-Aldrich, Германия) и 0,9 % раствор NaCl (контроль) вводили в виде водного раствора внутрижелудочно (в/ж) в профилактическом и лечебном режиме за 30 мин до холодовой травмы и в последующие дни эксперимента ежедневно однократно. Использовали следующие дозы: АСК 25 мг/кг, «Глюкозамин-С БХФЗ» 82,5 мг/кг и Г г/х 50 мг/кг.

Животных разделили на 5 групп: 1 группа - интактный контроль (n = 8), крысам вводили раствор NaCl (1 мл/100 г); 2 - контрольная патология (КП): раствор NaCl (1 мл/100 г) + холодовая травма (n = 15); 3 - АСК (25 мг/кг) + холодовая травма (n = 14); 4 - «Глюкозамин-С БХФЗ» в дозе 82,5 мг/кг (эта доза эквивалентна 50 мг/кг Г г/х) + холодовая травма (n = 14); 5 - Г г/х (50 мг/кг) + холодовая травма (n = 14).

На 3 и 10 сутки после эксперимента оценивали систему свертывания крови: время свертывания крови [15], протромбиновое время (ПТ), тромбиновое время (ТТ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Для определения этих показателей использовали стандартные наборы: ПТ (Технология Стандарт, Россия), ТТ (НПО «РЕНАМ») и АЧТВ (Технология Стандарт, Россия).

Для статистической обработки результатов использовали критерий Стьюдента при нормальном распределении, при его отсутствии - непараметрический критерий W Уайта.

Результаты и обсуждение. В группе КП и в группе, получавшей АСК, на первые сутки эксперимента наблюдали летальность 14,2% (по 1 из 7 крыс) после острой локальной холодовой травмы. В других группах летальности не было.

Динамика массы тела у исследуемых животных на 3 сутки снижалась во всех исследуемых группах, которые были подвержены острой локальной холодовой травме (табл.1). Так, в группе КП масса снижалась на 6,2%, АСК - на 12,5%, «Глюкозамин-С БХФЗ» - на 8%, Г г/х - на 5,6%, что свидетельствует о тяжести модельной патологии. На 5-10 сутки маса животных постепенно восстанавливалась по отношению к исходным данным. К 10 суткам имел место положительный прирост массы в группе «Глюкозамин-С БХФЗ» (на 1%), Г г/х (на 0,8%), тогда как в группе КП и АСК масса тела была ниже исходной на 0,7% и 2,6%.

Таблица 1- Показатели массы тела (г) у крыс на 3, 5 и 10 сутки после острой локальной холодовой травмы

Примечание:

* - отличие достоверно по отношению к исходным данным, р < 0,05.

Патогенез локальной холодовой травмы характеризуется выраженной воспалительной реакцией с нарушением целостности кожного покрова. В группе КП площадь поражения возрастала (табл. 2), достигая на 3 сутки достоверного различия с исходной (+5,8%), и сохранялась до 5 суток. Лишь к 10 суткам площадь поражений кожи приближалась к исходным величинам.

На 1-5 сутки после холодовой травмы в группах АСК и «Глюкозамин-С БХФЗ» наблюдали достоверное увеличение площади поражений кожи по отношению к исходным данным на 7,7% и 7,9% соответственно. К 10 суткам в группе АСК началось уменьшение площади поражения, а под влиянием «Глюкозамин-С БХФЗ» она была на 0,96% ниже исходной.

На 5 сутки под влиянием Г г/х наблюдалась тенденция к снижению этого показателя, а на 10 сутки и достоверное уменьшение площади на 0,77%, в то время как под влиянием АСК наблюдалась лишь тенденция к снижению.

Таблица 2 - Динамика площади поражений кожи у крыс на 1, 3, 5 и 10 сутки после острой локальной холодовой травмы (см²).

Примечание:

* - отличие достоверно по отношению к исходным данным, р < 0,05;

При исследовании свертывающей системы крови в группе контрольной патологии под влиянием острой локальной холодовой травмы на 3 сутки эксперимента наблюдали достоверное снижение времени свертывания крови в 2,1 раза, ТТ в 1,8 раза и АЧТВ 1,2 раза с одновременным повышением ПТ в 2,3 раза относительно группы интактного контроля. Эти изменения указывают на риск тромбоза сосудов и развития ДВС-синдрома (рис.1).

Из литературы известно, что на 1-3 сутки после местной холодовой травмы происходит стойкий спазм сосудов с выраженным расстройством кровообращения. В результате спазма наступает

замедление кровотока с последующим тромбозом сосудов, в патогенезе которого важную роль играют изменения коагуляционных и реологических свойств крови (повышение вязкости) [16-18]. Наши результаты в группе КП подтверждают эти данные.

АСК это классический антитромбоцитарный препарат с выраженным противовоспалительным действием. За счет ингибирования тромбоксансинтазы тромбоцитов АСК угнетает образование тромбоксана А2, проявляя антиагрегационный, антитромботический эффект [19]. На модели острого локального охлаждения (отморожение) АСК не проявила антитромботических свойств, достоверно снижая время свертывания крови, ПТ и ТТ на уровне показателей группы КП (рис.1).

Под действием «Глюкозамина-С БХФЗ» и Г г/х 9 (рис.1) на 3 сутки эксперимента

наблюдалось достоверное снижение времени свертывания крови в 1,87, 1,8 и 1,7 раза по отношению к интактному контролю, но этот показатель был достоверно выше по отношению к КП. «Глюкозамин-С БХФЗ» достоверно снижал ТТ в 1,5 раза, достоверно повышал уровень ПТ в 2 раза по отношению к интактному контролю (рис.1). Под действием Г г/х наблюдается тенденция к снижению показателя ТТ и повышения уровня ПТ. Показатель АЧТВ под действием препаратов АСК, «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/х имел тенденцию к снижению.

Примечание:

*- отличие достоверно по отношению к интактному контролю, р < 0,05;

# - отличие достоверно по отношению к контрольной патологии, р < 0,05.

Повышение протромбинового времени может свидетельствовать о нарушении функции печени и о риске развития ДВС-синдрома. Укорочение АЧТВ может объясняться развитием воспалительной реакции, повышающей риск тромбоэмболии вследствие действия острой локальной холодовой травмы [20].

На 10 сутки эксперимента риск тромбообразования снижался во всех экспериментальных группах (рис.2). При приеме препаратов АСК и «Глюкозамин-С БХФЗ» отмечена тенденция к нормализации показателей времени свертывания, ТТ, ПТ И АЧТВ. Под влиянием Г г/х эта тенденция была заметно выше и показатели приближались к уровню интактного контроля. Это указывает на восстановление нормальной способности крови к свертыванию, а также на нормализацию функции печени.

Предыдущие исследования диетической добавки «Г люкозамина-С БХФЗ» и Г г/х на модели острой холодовой травме показали, что при АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов препараты снижают степень и скоростьагрегацииотносительногруппы КП.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о том, что препараты глюкозамина «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/х на модели острой локальной холодовой травмы лучше восстанавливают общее состояние животных (динамика массы тела), ускоряют снижение площади повреждения кожи и восстанавливают состояние показателей свертывающей системы крови. Наиболее выраженный положительный эффект оказывает Г г/х. Исходя из этого, можно рекомендовать препараты глюкозамина гидрохлорида в комплексном лечении отморожений в клинике.

Выводы:

В результате острой локальной холодовой травмы у крыс группы контрольной патологии на 13 сутки исследования снижается масса тела, увеличивается площадь повреждения кожных покровов, снижается время свертывания крови и показатели фактора свертывания ТТ, ПТ, АЧТВ.

Препараты глюкозамина «Глюкозамин-С БХФЗ» и Г г/х в течение 10 суток исследования способствуют нормализации массы тела, уменьшению площади повреждения кожи и восстановлению времени свертывания крови.

Под действием АСК на первые сутки после воспроизведения модельной патологии наблюдалась 14,2% летальность животных (1 из 7 крыс). К 10 суткам масса тела при введении АСК была ниже исходной, менее выражено снижение площади поражений кожи. Препарат не проявил антитромботических свойств при данной патологии.

Литература

1. Бадюк М.І., Токарчук В.П., Солярик В.В. та ін. Відмороження //Військово-медичнапідготовка. Підручник - Киів. -2007. - С.275-281.
2. Бігудяк В.В. Відмороження та замерзания // Військовахірургія з хірургіею над звичайних ситуацій. Розділ 7. Тернопіль «Укрмедкнига». -2004. -С.130-139.
3. Рощін Г.Г., Кукуруз Я.С., Сличко І.Й. Медико-соціальні пробеми холодово 1 травми серед населенняУкрахни // Політравма. Сучаснаконцепціянаданиямедично^допомоги. Киів. -2006. - С.20-21.
4. Гур'ев С.О. Алгоритмилікувальноі тактики хворих з холодовою травмою, відмороження мокремихділянок та сегментівтіла / С.О.Гур'ев, Г.Г. Рощін, Я.С. Кукуруз, М.Д. Близнюк // Методичні рекомендаціі. ДЗ «Украінськийнауково-практичний центр екстреноімедичноідопомоги та медицини катастроф МіністерствоОхорониздоров'яУкраіни», Киів. - 2014. - 40с.
5. Абиев, З.А. Анализ влияния холодовых воздействий на организм человека / З.А. Абиев, Н.Н. Кленин, И.Н. Маслова // Прикладные информационные аспекты медицины. - 2007. - Т. 10. - № 2. - С. 54-58.
6. Афанасьева, Р.Ф. Холодовой стресс, критерии оценки, прогнозирование риска охлаждения человека / Р.Ф. Афанасьева, О.В. Бурмистрова // Безопасность жизнедеятельности. - 2006. - № 2. - С. 16-20.
7. Голохваст, К.С. Некоторые аспекты механизма влияния низких температур на человека и животных (литературный обзор) / К.С. Голохваст, В.В. Чайка // Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - Т. 18. - № 2. - С. 486-489.
8. Сметанина, М.Д. Показатели функционального состояния сердечно- сосудистой системы при холодовом воздействии на человека / М.Д. Сметанина, Л.Н. Шорина, Т.В. Тарасова // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. - 2010. - Т. 10. - № 1. - С. 47-49.
9. Михайличенко, М.И. Лимфоцитарно-тромбоцитарные взаимодействия у больных с холодовой травмой / М.И. Михайличенко, К.Г. Шаповалов, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. - 2006. - № 2. - С. 20-22.
10. Вихриев Б.С., Кичемасов С.Х., Скворцов Ю.Р. Местные поражения холодом. Л.: Медицина, 1991. 192 с.
11. Бондарев С.В. Агрегаціятромбоцигівпідвпливомпрепаратівглюкозамінугідрохлориду та ацетилсаліциловоікислоти пригострійхолодовійтравмі / С.В. Бондарев, С.Ю. Штриголь, І.А. Зупанець, І.А. Отрішко // Клінічнафармація 2017. - Том 21, № 1. - С. 50- 56.
12. Бондарев С.В. Вплив глюкозамінугідрохлориду на стан центральноі нервовоі системи та фізичну витривалість мишей після гострого загального охолодження / С.В. Бондарев, С.Ю. Штриголь // Украінській біофармацевтичний журнал. -2010. -№5 ( 1 0). -С. 60-65.
13. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1 / под ред. А. Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
14. Бойко В.В. Изучение морфологических особенностей в тканях экспериментальных животных при моделировании холодовой травмы / В.В. Бойко, А.Э. Миловидова, Л.Г. Яновская // Вістникморфологіі.-2010. -№16(3). - С.526-529.
15. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимическимисследованиям и лабораторнойдиагностике / В. С. Камышников. - М. :МЕДпресс-информ,2009. - 889с.
16. Agren, A. In vitro combinations of red blood cell, plasma and platelet components evaluated by thromboelastography / A. Agren, G. Edgren // Blood Transfus. - 2014. - Vol. 12. - P. 491-497.
17. Dietrich W. D. Protection in animal models of brain and spinal cord injury with mild to moderate hypothermia / W. D. Dietrich, C. M. Atkins, H. M. Bramlett // Journal of Neurotrauma. - 2009. - Vol. 26. - P. 301-312.
18. Fatal hypothermia: an analysis from a sub-arctic region / H. Brandstrom, A. Eriksson, G. Giesbrecht et al. // Critical Care. - 2012. Vol. 1(9). P. 325-328.
19. Бездетко, Н. В. Фармакокинетика ацетилсалициловой кислоты: мысли и факты / Н. В. Бездетко // Рациональная фармакотерапия. - 2015. - № 3 (36). - С. 28-31.
20. Wolfgang Korte, MD, Susan Clarke, MT(ASCP), and Jerry B. Lefkowitz, MD. Short Activated Partial Thromboplastin Times Are Related to Increased Thrombin Generation and an Increased Risk for Thromboembolism // Am J ClinPathol. - 2000. - Т. 113. - С. 123-127.