АННОТАЦИЯ

Иммуногистохимическая оценка апоптоза в щитовидной железе и тимусе потомства в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия пестицидов.

Выявлено, что как фипронил, так и цигалотрин при воздействии через организм матери вызывают выраженную индукцию апоптоза в щитовидной и вилочковой железах потомства. Пестициды цигалотрин и фипронил в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия вызывают индукцию апоптоза в щитовидной и вилочковой железах потомства. В механизме индукции апоптоза клеток, наряду с прямым токсическим действием препаратов, важную роль играют гипотиреоз и окислительный стресс, наблюдаемые у потомства. Индукция апоптоза клеток более выражена при воздействии фипронилом по сравнению с цигалотрином.

Ключевые слова: пестициды,постнатальный онтогенез, щитовидная железа, тимус, апоптоз, иммунногистохимия.

Введение.

Программируемая смерть клетки (ПСК) или апоптоз является механизмом, имеющим решающее значение для организма при контроле пролиферации клеток и поддержании гомеостаза тканей [1,2,3]. В физиологических условиях между процессами апоптоза и пролиферации клеток существует определенное равновесие, которое позволяет поддерживать тканевой гомеостаз [1,4]. Дефекты в физиологических механизмах апоптоза могут привести к различным заболеваниям человека, в том числе и развитию злокачественных новообразований [1,3]. Этим объясняется большой интерес к углубленному изучению механизмов апоптоза и его эффекторных белков, а также генов, ответственных за апоптоз. Результаты этих исследований открыли бы большие возможности управлять процессом апоптоза и разрабатывать новые способы лечения различных заболеваний, в том числе и онкологических [1]. За последние годы выявлено, что многие загрязнители окружающей среды, в том числе и пестициды новых поколений, выступают в качестве триггеров апоптоза клеток [2,4,5,6]. Установлено, что один из самых широко распространенных и эффективных инсектицидов фипронил (Ф) существенно индуцирует апоптоз в линии клеток SH-SY5Y и DrosophilaS2 в условиях in vitro [7,8]. Другой, не менее распространенный, пестицид пиретроидного класса ламбда-цигалотрин (Ц) приводил к увеличению фрагментации ядра клеток костного мозга крыслимфоцитов крови человека, что указывало на индукцию апоптоза [6,9]. Большинство авторов считает, что индукция апоптоза под влиянием пестицидов связана с развитием окислительного стресса и последующей активацией ферментов семейства каспаз и апоптоз-стимулирующих белков семейства р53 [2,5,6,7,8]. Тем не менее, надо отметить, что все эти исследования проведены на клеточных линиях или на взрослых особях лабораторных животных. Ранее нами было показано,чтовнутриутробное и раннее постнатальное воздействие пестицидов через организм матери оказывает отрицательное влияние на органы эндокринной и иммунной систем потомства, приводя к их структурным и функциональным нарушениям роста и становления в динамике постнатального онтогенеза [10,11]. Однако, значение процессов апоптоза клеток в механизме этих нарушений остается невыясненным.

Цель исследования - иммуногистохимическая оценка апоптоза в щитовидной железе и тимусе потомства в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия пестицидов.

Материал и методы.

Опыты проводились на нерожавших, белых половозрелых крысах-самках, которые были подразделены на 3 группы по 30 животных в каждой. Две группы животных в течение 30 дней ежедневно peros получали соответственно пестициды цигалотрин (8 мг/кг) или фипронил (3,6 мг/кг). Третья группа, получавшая только аналогичный объем стерильного физиологического раствора, служила контролем. На следующие сутки самки были подсажены к здоровым самцам. Наступление беременности контролировали по наличию спермы во влагалищных мазках. Введение пестицидов самкам продолжалось непрерывно во время беременности и после родов вплоть до окончания лактации. Потомство, полученное от опытных и контрольных самок, исследовали в динамике на 3,7,14, 21 и 30 сутки после рождения. Для иммуногистохимической оценки апоптозных клеток использовали парафиновые срезы щитовидной железы и тимуса. Апоптозные клетки выявляли с помощью моноклональных кроличьих антител к фрагментам каспаз-3 и белкам семействар-53 (производства Thermo Scientific, USA). Дальнейшие процедуры по визуализации меченых пероксидазой хрена апоптозных клеток проводились по стандартной схеме с помощью комплекса реагентов UltraVision (производства Thermo Scientific, USA). Срезы докрашивали метиленовым синим или нейтральным красным. Далее подсчитывали число меченых апоптозных клеток на 1000 - 5000 клеток среза и вычисляли индекс апоптоза в промиллях (%0). Все цифровые данные были обработаны методом вариационной статистики. Статистическая значимость между контролем и опытными группами сравнивалась с использованием теста Стьюдента и значения Р<0,05 считались достоверными.

Результаты и обсуждение.

Апоптозные клетки на срезах после проведения иммуногистохимической реакции выглядели темно-коричневыми за счет визуализации меченых пероксидазой хрена вторичных антител. Следует заметить, что частота выявления апоптозных клеток в ткани щитовидной железы как контрольных, так и опытных групп животных была значительно ниже, чем в тимусе (рис.1, 2).

Различия между уровнями апоптоза клеток щитовидной железы и тимуса наиболее отчетливо проявлялись при количественном подсчете индекса апоптоза. Эти данные приведены в виде графиков (рис.3,4). Как видно из рис.3, уровень апоптоза в щитовидной железе контрольных животных очень низкий, по мере постнатального развития апоптоз умеренно усиливается.

В тимусе апоптоз изначально высокий, он значительно нарастает в динамике постнатального роста животных. Из приведенных графиков также видно, что внутриутробное и раннее постнатальное воздействие использованных пестицидов приводит к достоверному увеличению степени апоптозаклеток как щитовидной железы, так и тимуса. При этом индукция апоптоза клеток проявляется в более высокой степенипри воздействии фипронила, нежели при воздействии цигалотрина.

Таким образом, как фипронил, так и цигалотрин при воздействии через организм матери вызывают выраженную индукцию апоптоза в щитовидной и вилочковой железах потомства. Наши предыдущие исследования показали, что оба пестицида в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия вызывают замедление темпов роста и становления щитовидной железы, снижение функции органау потомства в виде гипотиреоза [10,11]. При этом гипотиреоз был более выражен при воздействии фипронилом по сравнению с цигалотрином.

Данные последних лет показывают, что гормоны щитовидной железы обладают высоким анти-апоптическим эффектом, что открывает большие перспективы для регуляции процесса апоптоза при различных заболеваниях [3].

Все это позволяет считать, что выраженность индукцииапоптоза в наших опытах в известной мере определяетсястепенью нарушения функции щитовидной железы и ослаблением анти-апоптического действия ее гормонов. Это подтверждается нашими данными, указывающими на более выраженную индукцию апоптоза при воздействии фипронилом. С другой стороны, важную роль в индукции апоптоза играет окислительный стресс, обусловленный увеличением продукции свободных радикалов [2,4].

Ранее нами было показано, что оба пестицида в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия вызывают выраженный окислительный стресс у потомства [12,13]. Следовательно, индукция апоптоза у опытного потомства обусловлена не только прямым токсическим действием пестицидов, но ив значительной степени опосредована ослаблением анти- апоптической функции тиреоидных гормонов вследствие гипотиреоза и возникающим окислительным стрессом в виде возрастания количества свободных радикалов.

Заключение.

Пестициды нового поколения цигалотрин и фипронил в условиях внутриутробного и раннего постнатального воздействия вызывают индукцию апоптоза в щитовидной и вилочковой железах 6

потомства. В механизме индукции апоптоза клеток, наряду с прямым токсическим действием препаратов, важную роль играют гипотиреоз и окислительный стресс, наблюдаемые у потомства. При этом индукция апоптоза клеток более выражена при воздействии фипронилом по сравнению с цигалотрином. Раскрытие механизмов индукции апоптоза при воздействии пестицидов нового поколения способствует разработке патогенетических способов профилактики и лечения скрытых токсических эффектов у беременных женщин и их новорожденных детей.

Литература

1. Goldar S. Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment / M.S.Khaniani, S.M.Derakhshan, B.Baradaran // Asian Pac J Cancer Prev. -2015. -Vol.16. -N. 6. -P. 2129-2144.
2. Ki Y.W. Reactive oxygen species and mitogen-activated protein kinase induce apoptotic death of SH-SY5Y cells in response to fipronil / J.E.Lee, J.H.Park, I.C.Shin, H.C.Koh // Toxicol Lett. - 2012. -Vol.211. -N. 1. -P.18-28.
3. Lin H.Y. Thyroid hormone and anti-apoptosis in tumor cells / G.V.Glinsky, S.A.Mousa, P.J.Davis // Oncotarget. -2015. -Vol.6. -N.17. -P.14735-14743.
4. Park J.H. Meloxicam inhibits fipronil-induced apoptosis via modulation of the oxidative stress and inflammatory response in SH-SY5Y cells / Y.S.Park, J.B.Lee, K.H.Park // J Appl Toxicol. - 2015. Mar 13. doi: 10.1002/jat3136.
5. Lee J.E. Akt/GSK3e signaling is involved in fipronil-induced apoptotic cell death of human neuroblastoma SH-SY5Y cells / J.S. Kang, Y.W.Ki, S.H.Lee // Toxicol Lett. -2011. -Vol.202. - N.2. -P.133-141.
6. Muranli F.D. Genotoxic and cytotoxic evaluation of pyrethroid insecticides Vcyhalothrin and a- cypermethrin on human blood lymphocyte culture // Bull Environ Contam Toxicol. -2013. - Vol.90. -N.3. -P.357-363.
7. Vidau C. Fipronil is a powerful uncoupler of oxidative phosphorylation that triggers apoptosis in human neuronal cell line SHSY5Y / R.A.Gonzalez-Polo, M.Niso-Santano, R.Gomez-Sanchez // Neurotoxicology. -2011. -Vol.32. -N.6. -P.935-943.
8. Zhang B. Fipronil induces apoptosis through caspase-dependent mitochondrial pathways in Drosophila S2 cells / Z.Xu, Y.Zhang , X.Shao // PesticBiochem Physiol. -2015. -Vol.119. -P.8189.
9. Celik A. Induction of micronuclei by lambda-cyhalothrin in Wistar rat bone marrow and gut epithelial cells / B.Mazmanci, Y.Camlica, A.Askin, U.Comelekoglu // Mutagenesis. -2005. - Vol.20. -N. 2. -P.125-129.
10. Tukhtaev K.R. Effect of prolonged exposure of low doses of lamda-cyhalothrin on the thyroid function of the pregnant rats and their offspring / N.B.Zokirova, S.K.Tulemetov, N.K.Tukhtaev // Medical and Health Science Journal. -2012. -Vol.13. -P.86-92. www.pradec.en
11. Tukhtaev K.R. Effect of Prolonged exposure low doses of Fipronil on thyroid function of pregnant rats and their offspring / N.B.Zokirova, S.K.Tulemetov, N.K.Tukhtaev // The Internet Journal of Toxicology. -2013. -Vol.10. -N.1. www.ispub.com /IJTO/10/1/14550.
12. Tukhtaev K.R. Effect of long term exposure low doses of lambda-cyhalothrin on the level of lipid peroxidation and antioxidant enzymes of the pregnant rats and their offspring / S.K.Tulemetov, N.B.Zokirova, N.K.Tukhtaev // Medical and Health Science Journal. -2012. - Vol.13. -P.93-98. www.pradec.en
13. Tukhtaev K.R. Prolonged exposure of low doses of Fipronil causes oxidative stress in pregnant rats and their offspring / S.K.Tulemetov, N.B.Zokirova, N.K.Tukhtaev // The Internet Journal of Toxicology. -2013. -Vol.10. -N.1. www.ispub.com /IJTO/10/1/14550.