Метилирование генов gstp1, apc и rarb как критерий инициации и прогрессии прединвазивных изменений эпителия простаты

АННОТАЦИЯ

В работе представлены результаты изучения уровня метилирования промоторной области генов GSTP1, APC, RARe у больных с гистологически верифицированной доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ). Объектом исследования была ткань предстательной железы (77 больных). Показано, что более высокая частота и уровень метилирования в ткани предстательной железы связаны с более частым выявлением в ней переходных морфологических изменений. Предложен индекс уровня метилирования, который значительно выше при наличии переходных изменений эпителия в ткани предстательной железы при ДГПЖ. Определен индекс уровня метилирования характерный для ДГПЖ. Повышение индекса уровня метилирования генов GSTP1, APC и RARe позволяет выделить группы риска по развитию рака предстательной железы, обосновать необходимость активного наблюдения и повторной биопсии.

Ключевые слова: доброкачественная гиперплазия предстательной железы, метилирование генов.

Введение. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает четвертое место по уровню заболеваемости среди всех злокачественных новообразований в мире [8]. В США рак простаты занимает ведущее место в онкологической заболеваемости среди мужчин, в странах Европейского Союза - второе место. Ежегодно в мире регистрируется около полумиллиона новых случаев РПЖ, что составляет примерно 10% всех опухолей [9], также эта патология является второй по частоте причиной смерти мужчин от онкологических заболеваний [6]. В Российской Федерации в структуре онкологических заболеваний мужско населения РПЖ занимает 3-е место, а по темпам прироста заболевания и смертности за период с 1998 по 2008 г. - 1-е место [1]. Приведенные данные демонстрируют актуальность проблемы РПЖ, а темпы прироста заболеваемости и смертности о недостаточной эффективности имеющихся возможностей по диагностике и лечению этого заболевания. На данный момент наиболее ценным опухолевым маркером, исследование которого в сыворотке крови необходимо для диагностики и наблюдения за течением гиперплазии и рака предстательной железы является простат-специфический антиген (ПСА). Параметры, оцениваемые этим тестом, показывают чувствительность до 70% и положительную прогностическую ценность от 26 до 52% [4].

Высокочувствительным этот маркер становится только при значениях более 20 нг/мл, однако для проведения радикального лечения РПЖ требуется выявление этого заболевания на ранних стадиях, а подавляющее большинство случаев локализованного рака приходится на так называемую «серую зону», когда значения ПСА находятся в промежутке 4-10 нг/мл. Биопсия предстательной железы, выполняемая в связи с повышением ПСА в пределах «серой зоны», зачастую подтверждает доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ), но выявляет переходные изменения в эпителии протоков предстательной железы. Наиболее часто при морфологическом исследовании у больных ДГПЖ выявляют простатическую интраэпителиальную неоплазию (ПИН) и атипическую мелкоацинарную пролиферацию (ASAP). Несмотря на то, что эти изменения расцениваются как пренеопластические, нет четкого понимания и единого мнения по дальнейшему ведению этой категории больных. Также морфологическое исследование не может ответить на вопрос о том, в каком случае переходное состояние перейдет в инвазивный рак, а в каком нет.

Рак предстательной железы зачастую сопутствует ДГПЖ и развивается на ее фоне, однако остается неизвестным, когда и какой фактор является пусковым в этом процессе. Для ответа на эти вопросы идет поиск новых методов диагностики РПЖ на стадии доклинического течения. Молекулярно-генетические методы позволяют выявить изменения характерные для рака до того, как он будет иметь специфические морфологические признаки. Так гиперметилирование промоторного региона гена супрессора опухолевого роста p16INK4A при плоскоклеточном раке лёгкого было обнаружено уже в гиперплазии [5]. Гиперметилирование промоторной области генов-супрессоров опухолевого роста является характерным эпигенетическим признаком опухолей разной локализации. В настоящее временя известно значительное число генов супрессоров опухолевого роста, инактивированных в различных опухолях путем гипеметилювання CpG- островков, локализованных в их регуляторных областях.

Среди них: гены Rb1, р53, VHL, BRCA1, MLH1 и другие [5,7,10,2,3]. Инактивация гена супрессора опухолевого роста происходит посредством феномена MAGI (methylation-associated gene inactivation), функциональное значение которого остается неизвестным. Изучение гиперметилирования генов супрессоров при раке предстательной железы позволяет рассчитывать на выявление молекулярно-генетических изменений свойственных заболеванию на стадии предопухолевого протекания.

Цель. Изучить метилирование промоторной области генов-супрессоров опухолевого роста GSTP1, APC, RARe при ДГПЖ. Оценить характер метилирования промоторной области, на основании сравнительного анализа показателей метилирования в ткани предстательной железы полученной после выполнения чреспузырной простатэктомии, ТУР предстательной железы и мультифокальной биопсии предстательной железы (МФБ). Оценить целесообразность использования уровня метилирования в качестве прогностического фактора у пациентов с ДГПЖ и возможность выделения больных группы риска по развитию РПЖ.

Материалы и методы. Клиническую группу исследования составили 77 больных ДГПЖ, проходивших обследование и лечение в урологическом отделении на базе Городской клинической больницы №10 г. Одессы. Все больные были разделены в зависимости от перенесенного хирургического вмешательства на три группы. В первую группу вошли 45 больных перенесших мультифокальную биопсию (МФБ) предстательной железы. Вторая была сформирована из 23 больных перенесших трансуретральную резекцию (ТУР) предстательной железы и третья из 9 больных перенесших чреспузырную простатэктомию. Больные первой, второй и третьей групп были сопоставимы по возрасту, который составил 67,91 (49; 83) лет, 70,13 (54; 84) лет и 66,77 (58; 80) лет соответственно. Медиана уровня ПСА в группе больных перенесших МФБ составила 15,27 (1,4; 88,8) нг/мл, в группе больных перенесших ТУР и чреспузырную простатэктомию 5,32 (0,6; 21,2) нг/мл и 6,56 (1,23; 17,18) нг/мл соответственно.

Медиана объема предстательной железы в первой группе составила 78,93 (34; 156) мл, во второй и третьей 59 (24; 83) мл и 97,88 (75; 126) мл соответственно. Объектом исследования была ткань, полученная путём выполнения трансректальной мультифокальной биопсии предстательной железы из 12 точек под ультразвуковым контролем, при помощи автоматического биопсийного пистолета фирмы «BARD», иглой размером 16G, а также ткань полученная после выполнения чреспузырной простатэктомии и ТУР простаты. Всем больным были выполнены молекулярно-генетические исследования, которые включали выделение ДНК из ткани предстательной железы, определение наличия метилирования промоторной области и подсчет количества метилированных копий генов GSTP1, APC, RARe. При работе с показателями уровня метилирования исследуемых генов нами введен индекс уровня метилирования, который является средним значением уровня метилирования трех генов. Статистическая обработка производилась с использованием непараметрических критериев Краскелла-Уоллеса.

Результаты исследований. Для определения характеристик метилирования у больных ДГПЖ, нами был проведен анализ частоты выявления метилирования промоторной области изучаемых генов. Средний возраст больных составил 68,4 лет (49; 84). Медиана уровня ПСА составила 11,4 нг/мл (0,6; 88,8). Средний объем предстательной железы составил 75 мл (±33,2). Метилирование промоторной области выявлялось у всех трех генов, но с разной частотой. Чаще всего метилирование встречалось у гена APC, в 34,6% из всех изученных образцов. У генов GSTP1 и RARe метилирование выявлено в 28% и 10,6% соответственно. Также мы изучили частоту встречаемости метилирования при ДГПЖ разделив больных в зависимости от способа получения материала. Обращает на себя внимание, что метилирование промоторной области всех трех генов выявляется чаще в группе больных где материал получен после МФБ предстательной железы. Так метилирование гена GSTP1 выявлено в 84,1%, когда материал получен после МФБ простаты, в 41,7% после ТУР предстательной железы и в 12,5% случаев после выполнения чреспузырной простатэктомии (табл. 1).

Таблица 1 - Частота выявления метилирования гена GSTP1 при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала

При исследовании гена APC получены следующие результаты. Если материал получали после МФБ предстательной железы метилирование выявлено в 93,2%, что выше, чем в случае гена GSTP1. В группе больных где материал получали после ТУР простаты или чреспузырной простатэктомии метилирование промоторной области гена встречалось в 75% и 50% соответственно, что также выше чем у гена GSTP1(табл. 2).

Таблица 2 - Частота выявления метилирования гена APC при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала

Эта закономерность распределения частоты метилирования в зависимости от способа получения материала свойственна и гену RARe. Наиболее высокая частота метилирования получена в группе больных, где материал получен после МФБ простаты - 72,7%, и это ниже аналогичных показателей генов GSTP1 и APC. В группе больных после ТУР простаты частота метилирования составила 33,3%, что также ниже, чем у предыдущих двух генов. В группе больных где материал получен после чреспузырной простатэктомии метилирование выявлено в 12,5%, что соответствует гену GSTP1 (табл. 3).

Таблица 3 - Частота выявления метилирования гена RARe при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала

Таким образом, видно, что метилирование промоторной области изучаемых генов- супрессоров опухолевого роста довольно часто выявляется у больных с доброкачественными изменениями предстательной железы. Мы получили закономерность частоты встречаемости метилирования в зависимости от способа получения матеириала и она свойственна всем трем генам. Для всех трех генов свойственна более высокая частота выявления метилирования у больных перенесших МФБ предстательной железы и самая низкая у больных перенесших чреспузырную простатэктомию. Мы провели анализ уровня метилирования в зависимости от получения материала и выявили, что он также отличается в разных группах. Уровень метилирования промоторной области гена GSTP1 в группе ТУР и чреспузырной простатэктомии равен нулю. Медиана уровня метилирования в группе МФБ равна 0,36% и это отличие статистически высоко значимо (табл. 4).

Таблица 4 - Уровень метилирования гена GSTP1 при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала.

*- несовпадение литер означает значимость различий между вариантами по тесту Краскелла-Уоллеса: Н(2, 76) =25,1; р<0,00001; одинаковые литеры означают незначимость различий.

Медиана уровня метилирования промоторной области гена APC в группе МФБ составила 0,39%, что соответствует медиане гена GSTP1 0,36%. Интересно, что максимальные значения у этих генов тоже близки, 2,28% для гена APC и 2,5% для гена GSTP1. Статистически значимых отличий в уровне метилирования гена APC в группе МФБ и ТУР не выявлено, в то время как уровень метилирования в ткани предстательной железы полученной после чреспузырной простатэктомии статистически значимо отличался от первых двух (табл. 5).

Таблица 5 - Уровень метилирования гена APO при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала.

*- несовпадение литер означает значимость различий между вариантами по тесту Краскелла-Уоллеса: H ( 2, N= 76) =7,8; p =0,021; одинаковые литеры означают незначимость различий.

Наиболее низкий уровень метилирования показал ген RARe. Медиана уровня метилирования в ткани полученной поле МФБ составила 0,03%. В ткани полученной после ТУР предстательной железы или чреспузырной простатэктомии метилирование равнялось нулю. Различие в уровне метилирования в ткани полученной после МФБ простаты с одной стороны и ткани полученной после ТУР или чреспузырной простатэктомии с другой стороны, статистически высоко значимо (табл. 6).

Таблица 6 - Уровень метилирования гена RARe при ДГПЖ в зависимости от способа получения материала.

*- несовпадение литер означает значимость различия вариантов по тесту Краскелла-Уоллеса: H ( 2, N= 76) =18,3; p =0,0001; одинаковые литеры означают незначимость различий.

Средний уровень ПСА в группе больных после МФБ практически втрое превышал таковой у больных после ТУР простаты или чреспузырной простатэктомии и составил 15,27 нг/мл, против 5,32 нг/мл и 6,56 нг/мл соответственно. Интересно, что выявленная нами закономерность рапределения частоты метилирования генов, для которой характерно большее значение при МФБ и снижение показателей при ТУР простаты и чреспузырной простатэктомии соответственно, также сохраняется при сравнении средних уровней метилирования. Средний уровень метилирования у всех трех генов выше в группе больных, где ткань получили после выполнения МФБ простаты, относительно уровня метилирования в группах больных после ТУР или чреспузырной простатэктомии. Так, например, для гена APC средний уровень метилирования промоторной области в ткани полученной после МФБ составил 0,39%, после ТУР 0,21% а после чреспузырной простатэктомии 0,09% (табл.7).

Таблица 7 - Показатели средних значений при разных способах получения материала.

Исходя из этих данных видно, что ткань морфологически идентифицированная как аденоматозностромальная гиперплазия имеет разный уровень метилирования в группах отличающихся по способу забора ткани. Для объяснения этого мы изучили морфологические характеристики образцов и выявили, что часть из них содержит переходные изменения в эпителии ацинусов как ПИН и мелкоацинарная атипическая пролиферация. Распределние таких образцов в общей структуре было следующим: в материале полученном после МФБ предстательной железы переходные состояния эпителия ацинусов (ПИН, ASAP) выявлены в 14 случаях (87,5%), в то время как в материале полученном после ТУР и чреспузырной простатэктомии выявлено по 1(6,25%) случаю ПИН. Таким образом, переходные изменения эпителия ацинусов предстательной железы чаще встречаются в ткани полученной после выполнения МФБ. Для образцов ДГПЖ в сочетании с переходными состояниями эпителия характерен более высокий уровень метилирования, что показали проведенные нами ранее исследования. Этим можно объяснить более высокий уровень метилирования в образцах ДГПЖ полученных после МФБ предстательной железы.

Для подтверждения этого мнения мы изучили уровень метилирования разделив образцы на содержащие ПИН или мелкоацинарную атипическую пролиферацию и без таких изменений. Данные по уровню метилирования в этих образцах представлены в таблице 8. Для наглядности в таблицу включен средний показатель ПСА, который не отличается в группе ДГПЖ содержащих переходные изменения и не содержащих. Однако, уровень метилирования разный. В образцах ДГПЖ в сочетании с ПИН он самый высокий и это свойственно всем трем генам. При сочетании ДГПЖ с атипической мелкоацинарной пролиферацией уровень метилирования ниже, чем при ДГПЖ в сочетании с ПИН, но на порядок выше, чем при типичной ДГПЖ. Для гена GSTP1 и APC профиль метилирования сходный. В случае гена RARe эта закономерность не прослеживается.

Таблица 8 - Уровень метилирования в образцах с разным гистологическим строением

По нашему мнению более высокий уровень метилирования промоторной области исследуемых генов в ткани предстательной железы при ДГПЖ объясняется большей частотой выявления в ней переходных состояний эпителия ацинусов, таких, как простатическая интраэпителиальная неоплазия и атипическая мелкоацинарная пролиферация. Это в свою очередь объясняется тем, что ткань полученная после ТУР простаты или чреспузырной простатэктомии представлена транзиторной зоной. А ткань полученная после МФБ предстательной железы представлена в 75,6% биоптатов периферичекой зоной, в которой, как известно, в большинстве случаев выявляют переходные изменения и в 75% рак предстательной железы. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что наличие переходных изменений эпителия ацинусов предстательной железы влияют на уровень метилирования промоторной области генов-супрессоров опухолевого роста повышая его. Проведенные нами ранее исследования показали, что метилирование является характерным признаком рака предстательной железы, а его уровень является более чувствительным методом и повышается при ПИН и ASAP, которые в настоящее время рассматриваются как предопухолевые состояния.

Таким образом, выявление более высокого уровня метилирования при МФБ у больных с ДГПЖ, может являться молекулярно-генетическим признаком предопухолевого процесса, который не определяется морфологически. Введенный индекс уровня метилирования отображает среднее значение по трем генам. Из таблицы 8 видно, что индекс уровня метилирования при ДГПЖ, когда отсутствовали переходные изменения эпителия, был самый низкий и составил 0,53. Индекс уровня метилирования 0,53 расценивается нами, как соответствующий типичной доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Превышение этого показателя может свидетельствовать о наличии переходных изменений в ткани предстательной железы, которые в соответствии с современными взглядами являются предопухолевыми.

Эти больные требуют тщательного динамического наблюдения за клиническими показателями, поскольку у них существует риск трансформации переходных изменений эпителия в инвазивную карциному. У этой категории больных может быть оправдано повторное выполнение МФБ предстательной железы в динамике, которая наряду с традиционной оценкой морфологического строения позволит определить уровень метилирования и получить дополнительную информацию о характере патологического процесса.

Выводы: Для образцов ткани предстательной железы полученной из периферической зоны характерен более высокий уровень метилирования промоторной области генов-супрессоров опухолевого роста, так как в ней с большей частотой выявляются переходные изменения эпителия. Повышение индекса уровня метилирования генов GSTP1, APC и RARe позволяет выделить больных группы риска по развитию рака предстательной железы, обосновать необходимость активного наблюдения и повторной биопсии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Злокачественные новообразования в России в 2008 году. Под редакцией В.И. Чиссова, В.В. Старинского, .В. Петровой. М.:ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2010. 256 с.
2. Лихтенштейн А.В., Киселева Н.П. (2001), Биохимия, 66, 293-317;
3. Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В., Матвеев В.Б. Рак предстательной железы.- М.-1999.- 153с.
4. Пушкарь Д.Ю. Простатспецифический антиген и биопсия предстательной железы / Д.Ю. Пушкарь. - М.: Медпресс-информ, 2003. - 159 с.
5. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia / S.B. Baylin, J.G. Herman, J.R. Graff [et al.] // Adv. Cancer Res. - 1998. - Vol. 72. - P. 141-196.
6. Cancer Facts and Figures. Atlanta: American Cancer Society, 2003.
7. Hanahan D., Weinberg R.A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100, 57-70.
8. Jemal A., Murray T., Ward E. et al. Cancer Statistics, 2005 // CA Cancer J. Clin.— 2005.— Vol 55.— P. 10—
9. Quinn, M. and Babb, P.: Patterns and trends in prostate cancer incidence, survival, prevalence and mortality. Part I: international comparisons. BJU Int, 90: 162, 2002.
10. Robertson K.D., Uzvolgyi E., Liang G. et al (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2291-2298;