Полиморфизмы генов OGG1, ERCC2, PARP1, XRCC4, XRCC3 и ATM у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию

В статье отмечено, что полиморфные варианты генов, связанных с детоксикацией и поддержанием редокс-баланса организма, могут быть ассоциированы с индукцией активных радикалов и оксидатив-ным стрессом, возникающим в ответ на облучение. Представлен анализ распределения частот геноти­пов и аллелей по полиморфным локусам генов OGG1, ERCC2, PARP1, XRCC4, XRCC3 и ATM в группе лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию. Также приведен анализ ге­нотипов между группами тюркской и славянской этнической принадлежности и группами, разделен­ными по половому признаку.

Введение

Длительное облучение в малых и средних диапазонах доз вызывает целый ряд процессов и эф­фектов, которые могут не регистрироваться при облучении в высоких дозах. Могут реализовываться нестабильность генома, экспрессия генов, индукция синтеза белков, генные мутации, аберрации хро­мосом, повышение чувствительности к последующим воздействиям и многое другое [1-3]. Так, в лимфоцитах лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча, в отда­ленные периоды после начала радиационного воздействия наблюдалось повышение уровня сомати­ческих мутаций в гене Т-клеточного рецептора, частоты хромосомных аберраций (дицентриков, ацентрических колец, кольцевых хромосом и транслокаций), числа клеток с блоком клеточного цик­ла, ранней апоптотической гибели [4-6]. Кроме того, было отмечено возрастание риска развития эф­фектов стохастической природы, в первую очередь лейкозов, при этом время регистрации пика воз­никновения лейкемий зависит, главным образом, от дозы [7].

Молекулярные механизмы реализации отдаленных последствий хронического радиационного воздействия на сегодняшний день недостаточно полно ясны. Однако накоплено множество данных, указывающих на то, что точечные мутации, частота встречаемости которых в популяции не менее 1 % (однонуклеотидные генетические полиморфизмы), в генах систем репарации ДНК, контроля кле­точного цикла и апоптоза могут модифицировать ответ организма на радиационное воздействие и влиять на развитие отдаленных последствий. Полиморфизмы в гене OGG1, участвующем в эксцизи-онной репарации оснований, связаны с повышенным уровнем хромосомных аберраций [8] и мутаций в гене TP53 [9], а также с онкопатологией мочевого пузыря [10], желчного пузыря [11], поджелудоч­ной железы [12], прямой кишки [13] и легких [14]. Полиморфные варианты гена ERCC2, относящего­ся к системе эксцизионной репарации оснований, были связаны с повышенной чувствительностью к 5-флюороурацилу в сочетании с облучением [15], с повышенным риском развития рака молочной железы у женщин, подвергавшихся низкоинтенсивному воздействию ионизирующего излучения [16], и c рядом других онкологических заболеваний [14, 17, 18]. Односайтовые замены в гене белка PARP1, который вовлечен в процесс эксцизионной репарации нуклеотидов, ассоциированы с такими эффектами, как повышенный уровень соматических мутаций в гене TP53 [9], снижение продолжи­тельности жизни [19], а также с повышенным риском развития онкопатологий различных локализа­ций [20-22].

Односайтовые замены в генах системы репарации ДНК по типу негомологичного соеди­нения концов также могут влиять на развитие отдаленных эффектов. Так, у носителей полиморфных генов XRCC4 был обнаружен повышенный риск развития рака молочной железы [23, 24]. В гене XRCC3, относящемся к системе гомологичной рекомбинации ДНК, встречаются однонуклеотидные полиморфизмы, ассоциированные c увеличением числа хромосомных делеций и транслокаций [8], а также с онкопатологиями различных локализаций: мочевого пузыря [25], молочной железы [26], толстой кишки [27], легких [14].

Помимо систем репарации ДНК, важную роль в поддержании гомеостаза организма играет и группа ферментов, регулирующих клеточный цикл. Например, поли­морфизмы в гене ATM связаны с повышенным риском развития радиационно-индуцированного па­пиллярного рака щитовидной железы [28] и с повышенным риском развития рака молочной желе­зы [29]. Таким образом, наличие полиморфизмов, ассоциированных с неэффективной репарацией и нарушениями регуляции клеточного цикла, в сочетании с генотоксическим действием ионизирующе­го излучения могут стать причиной повышенной вероятности развития отдаленных последствий об­лучения.

Характеристика обследованных лиц

В ходе работы были обследованы 172 человека. Данную группу составили люди, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию в 1950-1960 гг. в результате загрязнения радиоактивны­ми отходами ПО «Маяк» бассейна реки Течи [30]. Население прибрежных сел подверглось действию комбинированного внешнего (преимущественно у-) и внутреннего у- и Р-излучения с низкой ЛПЭ. Основными источниками внешнего у-излучения являлись: вода, донные отложения и пойменные почвы, а также участки территории населенных пунктов, загрязненные в результате хозяйственной деятельности (поливные огороды, механический перенос радиоактивности). Внутреннее облучение было обусловлено радионуклидами, поступавшими в организм с речной водой и продуктами питания местного производства (молоко, рыба, овощи с поливных огородов). Наиболее высокие уровни сум­марной Р-активности были обнаружены в рыбе и мясе водоплавающей птицы. Менее загрязненными смесью радионуклидов были молоко и овощи [31].

Основным дозообразующим радионуклидом был ⁹⁰Sr. Являясь аналогом кальция, стронций на­капливался и долгое время удерживался в костной ткани. Кроме того, значимый вклад в формирова­ние дозы внесли ¹³⁷Cs и ⁸⁹Sr, но, благодаря короткому периоду полураспада ⁸⁹Sr и быстрому выведе­нию из организма ¹³⁷Cs, облучение за счет этих радионуклидов реализовывалось только в первые 5 лет после их поступления [19]. Все обследованные имели индивидуальную реконструированную дозу на ККМ. Средняя доза на красный костный мозг составила 0,72±0,07 Гр. 61 процент обследо­ванных принадлежал к тюркской этнической группе (татары и башкиры), а 39 % — к славянской (преимущественно русские). В группе присутствовали как мужчины (32 %), так и женщины (68 %). Характеристика группы представлена в таблице 1.

Выделение ДНК и генотипирование

В исследовании использовались замороженные образцы крови, сохраняемые в банке тканей ФБГУН УНПЦ РМ. Одна часть ДНК была выделена с помощью набора реагентов iPrep PureLink gDNA Blood Kit на приборе Applied Biosystems Library Builder, а другая — методом фенол-хлороформной экстракции ДНК, включающем ряд этапов. После размораживания 700 мкл крови пе­реносили в пробирку эппендорф и добавляли 700 мкл ASSC. Центрифугировали при 12000 об./мин 2 минуты. К осадку добавляли 1400 мкл ASSC, перемешивали и вновь центрифугировали при 12000 об./мин 2 минуты. К осадку добавляли 270 мкл ацетатного буфера, 30 мкл 10 % SDS, инкуби­ровали при 37 °С 1 час. Затем проводилась очистка фенол-хлороформной смесью (50/50). После цен­трифугирования (12000 об./мин — 10 минут) надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку и осаждали ДНК 1000 мкл спирта (100 %). После кратковременного центрифугирования проводили отмывку 70 %-ным спиртом. Получившийся осадок ДНК высушивали и растворяли в 100 мкл де-ионизированной воды.

В исследование были включены полиморфизмы генов OGG1 (rs1052133), ERRC2 (rs13181), PARP1 (rs1136410), XRCC4 (rs2075685), XRCC3 (rs861539) и ATM (rs664677).

Генотипирование образцов и детекция результатов осуществлялись методом полимеразной цеп­ной реакции в реальном времени на приборе Applied Biosystems StepOnePlus с использованием набо­ров реагентов ФЛЭШ производства фирмы Gen-Expert (Москва).

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программного ком­плекса SPSS Statistics 17.0. Сравнение распределения генотипов для групп, отличающихся по этниче­скому или половому признаку, и проверку на соответствие равновесному распределению Харди-Вайнберга проводили с помощью критерия %².

Результаты и обсуждение

Для исследования были выбраны 6 полиморфизмов генов систем эксцизионной репарации осно­ваний (OGG1), эксцизионной репарации нуклеотидов (ERCC2, PARP1), негомологичного соединения концов ДНК (XRCC4), гомологичной рекомбинации (XRCC3) и контроля клеточного цикла (ATM), так как, по литературным данным, генетические варианты в данных системах могут быть связаны с увеличением уровня соматических мутаций, хромосомных аберраций и повышением вероятности развития онкопатологий [8, 32, 33]. Результаты генотипирования представлены в таблице 2.

Частоты минорных аллелей генов OGG1, PARP1 и XRCC3 достоверно отличались от соответст­вующих средних частот для объединенной европейско-азиатской популяции. Вариант OGG1 326Cys в исследованной группе встречался реже (P = 0,05), как и PARP1 742Ala (P = 0,03), а аллель XRCC3 241Met наблюдался значительно чаще (P < 0,01). Однако при этом они полностью согласова­лись со средними частотами для исключительно европейских популяций.

Распределение генотипов по всем исследованным локусам, кроме XRCC3 rs861539, соответство­вало закону равновесного распределения Харди-Вайнберга, что может говорить об отсутствии зна­чимых факторов отбора в отношении данных вариантов в исследованной популяции. Для XRCC3 rs861539 наблюдалось значительное снижение числа гетерозигот при равном увеличении количества гомозигот по сравнению с ожидаемым распределением (%² = 40,28; Р < 0,01).

Было проведено сравнение распределения генотипов между группами тюркской и славянской этнической принадлежности, а также между группами, разделенными по половому признаку. Резуль­таты анализа приведены в таблице 3.

Распределение генотипов гена XRCC4 сильно отличалось между этническими группами. У тюр-китов наблюдалось 65,5 % гомозигот по мажорному аллелю, 29,2 % гетерозигот и 8,3 % гомозигот по минорному аллелю, в то время как для славян распределение составляло 23,5; 50,0 и 26,6 % соответ­ственно. Также отмечалось различие в распределении генотипов варианта OGG1 rs1052133 между мужчинами и женщинами. Среди мужчин гомозиготы по мажорному аллелю встречались значитель­но чаще (76,0 %), чем среди женщин (43,9 %).

Заключение

Таким образом, результаты предварительного исследования показывают, что частоты минорных аллелей генов OGG1, PARP1 и XRCC3 достоверно отличались от соответствующих средних частот для объединенной европейско-азиатской популяции, однако при сравнении с частотами в европей­ской популяции различий не наблюдалось.

Распределение генотипов по всем исследованным локусам, кроме XRCC3 rs861539, соответство­вало закону равновесного распределения Харди-Вайнберга, что может говорить об отсутствии зна­чимых факторов отбора в отношении данных вариантов в исследованной популяции.

Распределение генотипов гена XRCC4 значительно отличалось между этническими группами. Также отмечалось различие в распределении генотипов варианта OGG1 rs1052133 между мужчинами и женщинами.

На данном этапе работы не представляется возможным сделать окончательные выводы о причи­не несоответствия распределения гена XRCC3 и различий в частоте встречаемости минорных алле­лей генов OGG1, PARP1, XRCC3. В связи с этим в дальнейшем планируется продолжение исследова­ний на расширенной группе людей.

Список литературы

1. Пелевина И.И., Алещенко А.В., Антощина М.М., Рябченко Н.И., Семенова Л.П., Серебряный А.М. Индивидуальная вариабельность в проявлении адаптивного ответа клеток человека на воздействие ионизирующей радиации. Подходы к ее определению // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2007. — Т. 47, № 6. — С. 658-666.
2. Smirnov D.A., Morley M., Shin E., Spielman S., Cheung V.G. Genetic analysis of radiation-induced changes in human gene expression // Nature. — 2009. — 459, No. 28. — P. 587-591.
3. Limoli C.L., Ponnaiya B., Corcoran J.J., Giedzinski E., Kaplan M.I. et al. Genomic instability induced by high and low LET ionizing radiation // Adv Space Res. — 2000. — 25. — P. 2107-2117.
4. Маркина Т.Н., Веремеева Г.А., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генахTCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому ра­диационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. — 2011. — № 1. — С. 41-49.
5. Veremeyeva G.A., Akushevich I.V., Ukraintseva S. V., Yashin A.I., Epifanova S.B., Blinova E.A., Akleyev A.V. A new approach to individual prognostication of cancer development under conditions of chronic radiation exposure // Int. Journal of Low Radiation. — 2010. — 7, No. 1. — P. 53-80.
6. Blinova E.A., Veremeyeva G.A., Akleyev A.V. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes and mutations in the gene of the T-cell receptor in survivors of chronic radiation exposure // Health Phys. — 2012. — 103, No. 1. — P. 58-60.
7. Krestinina L., Yu D.L., Preston E. V., Ostroumova E.V. et al. Protracted radiation exposure and cancer mortality in the Techa River Cohort // Radiat.Res. — 2005. — 164(5). — P. 602-611.
8. Минина В.И. Генетический полиморфизм и хромосомные аберрации, индуцированные радиацией // Сибирский ме­дицинский журнал. — 2012. — № 3.
9. Cho S. et al. Associations between polymorphisms in DNA repair genes and TP53 mutations in non-small cell lung cancer // Lung Cancer. — Vol. 73, No. 1. — P. 25-31.
10. Arizono K., Osada Y., Kuroda Y. DNA repair gene hOGG1 codon 326 and XRCC1 codon 399 polymorphisms and bladder cancer risk in a Japanese population // Jpn. J. Clin. Oncol. — 2008. — 38, No. 3. — P. 186-191.
11. Jiao X. et al. hOGG1 Ser326Cys polymorphism and susceptibility to gallbladder cancer in a Chinese population // Int. J. Cancer. — 2007. — 121, No. 3. — P. 501-505.
12. Zhang J. et al. Sequence variants in antioxidant defense and DNA repair genes, dietary antioxidants, and pancreatic cancer risk // Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. — 2011. — 2, No. 3. — P. 236-244.
13. Canbay E. et al. Association of APE1 and hOGG1 polymorphisms with colorectal cancer risk in a Turkish population // Curr. Med. Res. Opin. — 2011. — V 27, No. 7. — P. 1295-1302.
14. Hung R.J., Baragatti M., Thomas D., McKay J., Szeszenia-Dabrowska N., Zaridze D., Lissowska J., Rudnai P., Fabianova E., Mates D., Foretova L., Janout V., Bencko V., Chabrier A., Moullan N., Canzian F., Hall J., Boffetta P., Brennan P. Inherited predis­position of lung cancer: a hierarchical modeling approach to DNA repair and cell cycle control pathways // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. — 2007. — Vol. 16, No. 12. — P. 2736-2744.
15. Duldulao M.P., Lee W., Nelson R.A., Ho J., Le M., Chen Z., Li W., Kim, Garcia-Aguilar J. Gene polymorphisms predict toxicity to neoadjuvant therapy in patients with rectal cancer // Cancer. — 2013. — Vol. 119, No. 5. — P.1106-1112.
16. Rajaraman P., Bhatti P., Doody M.M., Simon S.L., Weinstock R.M., Linet M.S., Rosenstein M., Stovall M., Alexander B.H., Preston D.L., Sigurdson A.J. Nucleotide excision repair polymorphisms may modify ionizing radiation-related breast cancer risk in US radiologic technologists // J. Cancer. — 2008. — Vol. 123, No. 11. — P. 2713-2716.
17. Kiyohara C., Yoshimasu K. Genetic polymorphisms in the nucleotide excision repair pathway and lung cancer risk: a meta-analysis // Int. J. Med. Sci. — 2007. — 4, No. 2. — P. 59-71.
18. Mocellin S., Verdi D., Nitti D. DNA repair gene polymorphisms and risk of cutaneous melanoma: a systematic review and meta-analysis // Carcinogenesis. — 2009. — 30, No. 10. — P. 1735-1743.
19. Walston J.D. Inflammation and stress-related candidate genes, plasma interleukin-6 levels, and longevity in older adults // Exp. Gerontol. — 2009. — 44, No. 5. — P. 350-355.
20. Kim J., Pyun J.A., Cho S.W., Lee K., KwackK. Lymph node metastasis of gastric cancer is associated with the interaction be­tween poly (ADP-ribose) polymerase 1 and matrix metallopeptidase 2 // DNA Cell Biol. — 2011. — 30, No. 12. — P. 1011­1017.
21. Figueroa J.D. et al. Genetic variation in the base excision repair pathway and bladder cancer risk // Hum. Genet. — 2007. — 121, No. 2. — P. 233-242.
22. Smith T.R., Levine E.A., Freimanis R.I., Akman S.A., Allen G.O., Hoang K.N., Liu-Mares W., Hu J.J. Polygenic model of DNA repair genetic polymorphisms in human breast cancer risk // Carcinogenesis. — 2008. — Vol. 29, No. — 2132-2138.
23. Sehl M.E., Langer L.R., Papp J.C., Kwan L., Seldon J.L., Arellano G., Reiss J., Reed E.F., Dandekar S., Korin Y., Sinsheimer J.S., Zhang Z.F., Ganz P.A. Associations between single nucleotide polymorphisms in double-stranded DNA repair pathway genes and familial breast cancer // Clin. Cancer Res. — 2009. — Vol. 15, No. 6. — P. 2192-2203.
24. Zhou L.P., Luan H., DongX.H., Jin G.J., Ma D.L., Shang H. Association of functional polymorphisms of the XRCC4 gene with the risk of breast cancer: a meta-analysis // Asian Pac. J. Cancer Prev. — 2012. — 13, No. 7. — P. 3431-3436.
25. Figueroa J.D., Malats N., Rothman N., Real F.X., Silverman D., Kogevinas M., Chanock S., Yeager M., Welch R., DosemeciM., Tardon A., Serra C., Carrato A., Garcia-Closas R., Castano-Vinyals G., Garcia-Closas M. Evaluation of genetic var­iation in the double-strand break repair pathway and bladder cancer risk // Carcinogenesis. — 2007. — Vol. 28, No. 8. — P. 1788­
26. Silva S.N., Tomar M., Paulo C., Gomes B.C., Azevedo A.P., Teixeira V., Pina J.E., Rueff J., Gaspar J.F. Breast cancer risk and common single nucleotide polymorphisms in homologous recombination DNA repair pathway genes XRCC2, XRCC3, NBS1 and RAD51. Cancer Epidemiol. 2010 Feb;34(1):85-92.
27. Krupa R., Sliwinski T., Wisniewska-Jarosinska M., Chojnacki J., Wasylecka M., Dziki L., Morawiec J., Blasiak J. Polymor­phisms in RAD51, XRCC2 and XRCC3 genes of the homologous recombination repair in colorectal cancer — a case control study // Mol. Biol. Rep. — 2011. — 38, No. 4. — P. 2849-2854.
28. Akulevich N.M., Saenko V.A., Rogounovitch T.I., Drozd V.M., Lushnikov E.F., Ivanov V.K., Mitsutake N., Kominami R., Yamashita S. Polymorphisms of DNA damage response genes in radiation-related and sporadic papillary thyroid carcinoma // Endocr. Relat. Canc — 2009. — Vol. 16, No. 2. — P. 491-503.
29. Zhao L., Gu A., Ji G., Zou P., Zhao P., Lu A. The Association between ATM IVS 22-77 T>C and Cancer Risk: A Meta-Analysis // PLoS One. — 2012. 7, No. 1. — P. e29479. doi:10.1371/journal.pone. 2012.
30. Аклеев А.В. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча / Акле-ев А.В., Киселев М.Ф. — М.: Медбиоэкстрем, 2000. — 532 с.
31. ДегтеваМ.О., ВоробьеваМ.И., ТолстыхЕ.И., Шагина Н.Б., Кожеуров В.П. Дозиметрическая система реки Теча: ре­конструкция доз для оценки риска радиационных последствий // Вопросы радиационной безопасности. — 2000. — № 4. —С. 36-46.
32. Tolstykh E.I., Degteva M.O., Peremyslova L.M., Shagina N.B., Shishkina E.A., Krivoshchapov V.A., Anspaugh L.R., Na­pier B.A. Reconstruction of long-lived radionuclide intakes for Techa riverside residents: strontium-90 // Health Physics. — 2011. — 101. — P. 28-47.
33. Сальникова Л.Е. Генетическая детерминация эффектов ионизирующих излучений: цитогенетические и эпидемиоло­гические показатели: Дис. ... — М., 2011.