Исследование энтропийных показателей суточной динамики гормонов надпочечников в норме и при стрессе

Резюме: В данной статье рассмотрены возможности применение законов и методов термодинамики к физиологическим процессам в живых системах. Также, рассматриваются экспериментальные и математические анализы по выявлению суточной динамики гормонов надпочечников в норме и при стрессе и вычислению их энтропийных показателей. Стрессовое состояние биосистем характеризуется нарушением фазовой архитектоники циркадианных ритмов; десинхроноз является обязательным компонентом общего адаптационного синдрома. Уровень десинхроноза можно вычислять энтропией, физической величиной, так как, энтропия - мера беспорядочности. В данной статье мы описываем методы вычисления энтропии в хронобиологических исследованиях. Мы начнем с его использования в качестве простой сводной статистики беспорядка в ряде категорий и переходим к постулату экстремальной физической информации (EPI) в качестве основного научного принципа.

Развиваемая при стрессе реакция непосредственно связана с усилением активности желез внутренной секреции, происходит активация симпато-адреналовой системы. Длительность гипокинезии немонотонно влияет на уровень катехоламинов, имеется также зависимость развития стрессовой реакции, ее силы и продолжительность от сезона года.

Проведенные эксперименты показали, что в весенний период содержание гормонов надпочечников в плазме крови интактных крыс было подвержено флуктуациям в течение суток. Таким образом, мы можем использовать энтропию как критерий термодинамического состояния системы, так как энтропия может позволить определить не только путь необратимых процессов в открытой системе, но глубину тех или иных процессов.

Микрофлора толстой кишки является одним из факторов, определяющих нормальное функционирование слизистого барьера кишечника. У большинства обследованных больных ВЗК имелась генетическая предрасположенность к нарушению микробиоценоза кишечника. В настоящее время особое внимание уДеляется системе toll-подобных рецепторов (TLRs 1-13), отвечающих за распознавание компонентов клеточной стенки бактерий, активацию каскада провоспалительных цитокинов и интерлейкинов, формирование колонизационной резистентности и бактериальную транслокацию.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) представляют серьезную медицинскую и социально-экономическую проблему [1, 2]. Генетические мутации, увеличивающееся влияние неблагоприятных внешних факторов приводят не только к росту частоты ВЗК, но и к учащению внекишечных поражений и осложнений заболевания [1, 3]. Характер заболеваний (мультифакторный), особенности влияния предрасполагающих и провоцирующих факторов, ведущий патогенетический механизм при различных формах ВЗК существенно различаются. В то же время существует некоторая общность клинических симптомов и этиопатогенетических факторов, существенно затрудняющих дифференциальную диагностику между неспецифическим язвенным колитом (НЯК) и болезнью Крона (БК), что пролонгирует назначение своевременной адекватной терапии данных заболеваний. Значительное число диагностических ошибок, не всегда эффективная терапия приводят к увеличению длительности нетрудоспособности, инвалидизации, а иногда и смерти таких больных, что обусловливает особую актуальность, необходимость глубокого изучения данной патологии [1, 2, 4].

НЯК и БК являются полиэтиологическими заболеваниями, в возникновении которых значительную роль играет наследственная предрасположенность, реализующаяся под воздействием стрессов, пищевых погрешностей и кишечных инфекций посредством иммунологических нарушений. Микрофлора толстой кишки является одним из факторов, определяющих нормальное функционирование слизистого барьера кишечника [1,2]. Интоксикация продуктами жизнедеятельности бактерий толстого кишечника способна угнетать метаболическую и секреторную активность клеток кишечного эпителия, снижая резистентность слизистых барьеров, а вирусы могут изменять метаболизм колоноцитов, оказывать влияние на местный иммунный ответ [3, 4]. Кишечная палочка и бифидобактерии выполняют витаминообразующую функцию, способствуют синтезу незаменимых аминокислот, принимающих непосредственное участие в процессах регенерации слизистой кишечника [2, 5]. При изменениях микробиоценоза кишечника эти функции микрофлоры нарушаются. Кроме того, при нарушениях баланса анаэробно-аэробной флоры изменяется энергообеспечение колоноцитов [5, 6]. При этом нарушается секреторная функция бокаловидных клеток, снижается синтез муцинов, изменяются их состав и сво йства, нарушаются соотношения сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов, что приводит к нарушению защитных свойств слизи и поддерживает дисбактериоз. Нарушается и белковая структура муцинов, что снижает регенераторные возможности слизистой. Следовательно, нарушения микробиоценоза толстого кишечника у больных ВЗК вызваны изменением трофики колоноцитов, нарушением секреторной функции бокаловидных клеток, процессов пролиферации, дифференцировки и регенерации клеток кишечного эпителия.

Дисбиотические процессы в толстом кишечнике непосредственно влияют на изменения мукозного слоя слизистой оболочки толстого кишечника [1, 5]. Облигатная микрофлора кишечника способствует синтезу муцинов. Муцины, в свою очередь, являются трофическим, энергетическим сырьем для жизнедеятельности бактерий, формирования колонизационной резистентности. Вследствие нарушения хотя бы одного из компонентов слизистого барьера кишечника возникает феномен повышенной кишечной проницаемости, и кишечник становится источником поступления в организм большого количества антигенов, токсических соединений, которые способствуют поддержанию воспаления. Воспалительный процесс в кишечнике, вызванный патогенной флорой, ксенобиотиками или аллергенами, стимулирует клетки иммунной системы и поддерживает системный воспалительный процесс. Подтверждением важной роли слизистого барьера кишечника является уменьшение активности заболевания у больных ВЗК после восстановления микробиоценоза кишечника и уменьшения кишечной проницаемости [4, 6].

Характер изменения слизистого барьера кишечника отличается при различных типах ВЗК. При болезни Крона наблюдается нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет микобактерий, псевдомонад, иерсиний, патогенных штаммов эшерихий [1, 4, 6]. В то же время для больных НЯК характерен дисбактериоз со снижением количества бифидобактерий и лактобацилл, облигатной флоры и увеличением факультативных бактерий [2, 4, 5]. При НЯК определяется дефицит защитного слоя муцинов, а при БК отмечается избыток слизеобразования в кишечнике [4]. Одной из причин, определяющих различия в патогенезе изменений свойств кишечного барьера при НЯК и БК, может быть генетическая предрасположенность к восприятию антигенной нагрузки в кишечнике.

В настоящее время особое внимание уделяется системе toll-подобных рецепторов (TLRs 1-13), отвечающих за распознавание компонентов клеточной стенки бактерий, активацию каскада провоспалительных цитокинов и интерлейкинов, формирование колонизационной резистентности и бактериальную транслокацию [7-9]. TLR в большом количестве представлены на поверхности кишечного эпителия, а также обнаружены на моноцитах, макрофагах, в системной циркуляции и периферических органах и тканях, что свидетельствует о важной роли toll-подобных рецепторов в регуляции как местного, так и системного иммунного ответа [7, 9]. ТоП-подобные рецепторы активируются различными бактериальными или вирусными клеточными компонентами. Рецепторы распознают микробные структуры, так называемый патоген-ассоциированный микробный паттерн, и являются ключевым звеном в регуляции противомикробной протекции кишечника. Связывание рецепторов с бактериальным или вирусным антигеном приводит к активации факторов ядерной транскрипции (NF- B, JAK2), изменению экс-прессии провоспалительных цитокинов и индукции воспалительного ответа [7-10]. Повышенная экспрессия TLRs способствует активации цитокинов и интерлейкинов, избыточной продукции TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 [10, 11]. Точечная мутация в экзоне гена TLR-4 (хромосома 9q32-33) приводит к замене аспарагиновой кислоты на глициновую, потере отрицательного заряда в позиции 299 (Asp299Gly), что нарушает распознавание липополисахаридов бактерий как in vitro, так и in vivo, и развитию грамотрицательного сепсиса у животных, снижению ответа на бактериальный эндотоксин в эксперименте у человека [7, 12]. TLR-4 экспрессируется не только в кишечнике, но и на кардиомиоцитах, в головном мозге, лейкоцитах периферической крови [1, 7]. Изменение его экспресии может быть обусловлено как внешними факторами, так и генетической предрасположенностью, что может влиять на характер иммунного ответа у пациентов с ВЗК [12-14]. В то же время TLR-3 экспрессируется только на дендритных клетках [8, 13, 14, 16], следовательно, может являться первичным звеном, контактирующим с антигеном, распознающим и презентирующим компонентом иммунной системы кишечника. В эксперименте клетки TLR-3-дефицитных мышей характеризовались сниженной продукцией TNF-, IL-6, IL-12 и нормальным ответом на бактериальные полисахариды [11, 15, 17]. Возможно, различные нарушения экспрессии TLRs в кишечнике вследствие генетической предрасположенности способствуют формированию различных типов ответа на вирусные и бактериальные антигены, изменению качественного и количественного состава кишечной микрофлоры. Поэтому изучение ассоциаций нарушений микрофлоры кишечника в сочетании с анализом мутаций TLRs у пациентов с ВЗК представляется актуальным.

Целью данного исследования была оценка изменений качественного и количественного состава кишечной флоры у больных ВЗК в зависимости от генетической предрасположенности к нарушению иммунного ответа при дисбиотических процессах в толстом кишечнике у пациентов с НЯК и БК.

Материалы и методы.

Было обследовано 98 пациентов с ВЗК. Среди обследованных было 56 (57,1 %) больных НЯК и 42 (42,9 %) пациента с болезнью Крона. Всем больным была проведена ДНК-диагностика в отделе молекулярно-генетических исследований ЦНИЛ МКТУ им. А. Яссави, включавшая анализ мутаций tool-подобного рецептора 3 — TLR-3 (мутация Phe412Leu) и toll-подобного рецептора 4 — TLR-4 (мутация Asp299Gly). ДНК выделена из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь». В работе были использованы диагностические тест-системы «SNP-экспресс», разработанные НПФ «Литех».

Анализ полиморфных ДНК-локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей электрофоретической детекцией. Реакция проводилась при следующих условиях: первичная денатурация при 93 °С в течение 1 мин, после которой следовали 35 циклов, состоящих из денатурации при 93 °С в течение 10 с, отжига праймеров при 64 °С в течение 10 с, элонгации при 72 °С в течение 20 с. ПЦР проводили на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 (Applied Biosystems). Анализ амплифицированных фрагментов производили путем электрофореза в 3% агарозном геле, окрашенном в бромистом этидии. Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом трансиллюминаторе TFX-20.M (Vilber Lourmat, Франция).

Для оценки изменений кишечного микробиоценоза проводили изучение облигатной и факультативной кишечной флоры, ее количественного и качественного состава. Забор кала проводился утром в стерильную посуду и в течение 1 часа доставлялся в микробиологическую лабораторию. Определяли количество бифидобактерий и лактобацилл, кишечной палочки; изучали количественный и качественный состав факультативной флоры с исследованием количества стафило-, стрепто- и энтерококков, клебсиелл, протея, энтеробактера, цитобактера, грибов рода Candida. Помимо определения количества микроорганизмов, изучали их ферментативные свойства.

Результаты и обсуждение.

Полиморфизм TLR-3, TLR-4 наблюдался более чем у половины обследованных больных ВЗК — 60 (65,2 %) пациентов. Мутация TLR-3 (Phe412Leu) встречалась чаще, чем TLR-4, и отмечалась у 37 (41,1 %) больных ВЗК. Преобладающее количество мутаций были гетерозиготными. Полные мутации (Leu/Leu) были отмечены только у 6 (16,2 %) обследованных пациентов с ВЗК. Частота встречаемости точечной мутации TLR-3 отличалась в зависимости от типа ВЗК. Гетерозиготные мутации (Phe/Leu) преобладали среди больных НЯК — 24 (64,9 %). Неполные мутации встречались с меньшей частотой при БК — 13 (35,1 %) пациентов. Гомозиготные мутации TLR-3 (Leu/Leu) также преобладали среди пациентов с НЯК — 4 (10,8 %), по сравнению с больными БК 2 (5,4 %) пациента, однако данные отличия не были достоверными. Таким образом, полиморфизм TLR-3 чаще наблюдался у больных НЯК, что может свидетельствовать о преобладании избыточного ответа на бактериальные полисахариды как облигатной, так и факультативной микрофлоры кишечника, запускающего каскад провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-6, IL-12), играющих ключевую роль в формировании ВЗК.

Мутация TLR-4 (Asp299Gly) у обследованных больных наблюдалась несколько реже, чем TLR-3, и встречалась только у 23 (25,0 %) пациентов с ВЗК. У всех больных отмечались только гетерозиготные мутации TLR-4 (Asp/Gly). Полиморфизм TLR-4 превалировал у больных БК 15 (65,2 %) случаев, в отличие от больных НЯК, среди которых данная мутация наблюдалась лишь у 8 (34,8 %) пациентов. Следовательно, снижение или отсутствие способности к адекватному распознаванию бактериальных липополисахаридов вследствие мутации TLR-4 более характерно для больных БК. Это приводит к снижению

ответа на бактериальный эндотоксин грамотрицательной флоры, индукции и хронизации воспалительного процесса в кишечнике. Возможно, это объясняет тот факт, что нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет патогенной микрофлоры, кишечные инфекции предшествуют развитию, а также провоцируют обострения у пациентов с болезнью Крона чаще, чем у больных НЯК.

Генетическая предрасположенность с сочетанной мутацией TLR-3 и TLR-4 наблюдалась только у 9 (9,8 %) больных ВЗК. При этом сочетанные мутации встречались с равной частотой у больных как НЯК, так и БК, что, возможно, связано с небольшим количеством наблюдений.

У всех 92 больных ВЗК были выявлены изменения количества и состава кишечной микрофлоры (таблица 1).

Таблица 1 - Родовой состав микробиоценоза кишечника у больных НЯК и БК

Род

микроорганизма

Здоровые

НЯК

БК

Частота,

%

Количество, ig КОЕ/г

Частота, %

Количество, ig КОЕ/г

Частота, %

Количество, ig КОЕ/г

1.Escherichia

100,0

7,82+0,24

100,0

6,75+0,61*

78 9** ***

3,84+0,50

2.Bifidobacterium

100,0

8,72+0,25

100,0

7,29+0,71*

100,0

8,41+0,69

3. Lactobacillius

100,0

6,60+0,14

96,1

5,77+0,51*

94,7

5,79+0,57

4.Enterococcus

100,0

6,37+0,33

65,6*

7,33+0,63

100,0

5,30+0,51

5.Enterobacter

24,0

1,11+0,32

40,8*

2,81+0,21*

39,4**

3,97+0,28

6.Staphylococcus

46,0

4,05+0,35

52,6*

4,41+0,43

13 2** ***

2,21+0,18

7.Klebsiela

32,0

0,99+0,27

40,6*

3,46+0,32*

18 2** ***

3,05+0,61*

8.Proteus

16,0

0,4+0,1

39,6*

2,52+0,25

47 4**

2,43+0,27

9.Citobacter

56,0

1,79+0,32

52,1*

3,12+0,22*

-

-

10.Candida

32,0

3,36+0,41

31,6

3,50+0,35

23,7

4,28+0,45

Примечание: * - р л0.05 при сравнении межДу группами больных НЯК и зДоровыми; ** - р л0.05 при сравнении межДу группами больных НЯК и зДоровыми;*** - р л0.05 при сравнении межДу группами больных НЯК и БК.

возрастает количество воспалительных клеток, При этом как у больных НЯК, так и БК патогенные микроорганизмы не определялись, а облигатная флора (бифидобактерии, лактобациллы и кишечная палочка) высевались почти у всех пациентов, однако их количество было значительно снижено. У пациентов с БК частота высеваемости E.coli была ниже — 30 (78,9%) случаев, чем у здоровых лиц, причем как ее общего количества, так и кишечной палочки со слабовыраженными

ферментативными свойствами за счет увеличения удельного веса гемолизирующей E.coli (до 50 %). У больных НЯК отмечалось только снижение количества кишечной палочки (6,75 ± 0,61). Энтерококки были выделены лишь у 63 (65,6 %) пациентов с НЯК (P < 0,05), а у пациентов с БК отмечалось снижение количества энтерококков (5,30 ± 0,51) при 100% высеваемости.

Снижение количества облигатной флоры приводило к понижению колонизационной резистентности и росту факультативных бактерий. Энтеробактер у больных НЯК высевался достоверно чаще, чем у здоровых (40,8 и 24,0 % соответственно, P < 0,01), при этом его количество также достоверно превышало показатели здоровых лиц. Частота встречаемости стафилококков у больных НЯК была выше — 52,6 %, чем у здоровых лиц, однако их количество достоверно не отличалось, при этом чаще высевались S.epidermidis, S.aureus. У пациентов с БК частота встречаемости стафилококков была значительно ниже — 5 (13,2 %), чем у здоровых (P < 0,03), а также пациентов с НЯК (P < 0,01). Клебсиеллы высевались достоверно чаще у больных НЯК — 39 (40,6 %) пациентов, при этом их количество превышало норму в 2,7 раза. У больных БК высеваемость клебсиелл была достоверно ниже — 7 (18,2 %) случаев, однако их количество превышало норму (3,05 ± 0,61 lg КОЕ/г) и достоверно не отличалось от показателей больных НЯК. Частота высеваемости протея у больных НЯК была выше в 2 раза, а у больных БК — в 3 раза, чем у здоровых лиц. Протей был выделен у 38 (39,6 %) пациентов с НЯК, и его количество 2,12 ± 0,22 lg КОЕ/г значительно превышало норму — 0,48 ± 0,19 lg КОЕ/г (P < 0,001). Чаще высевался протей рода P.mirabilis. У 18 (47,4 %) пациентов с БК был выявлен протей, причем его количество также превышало допустимые значения (2,43 ± 0,27). У пациентов с БК чаще высевался P.vulgaris. Цитобактер не определялся у пациентов с БК и был выявлен только у больных НЯК — 50 (52,1 %) пациентов (P < 0,05), его количество достоверно превышало нормальные показатели (3,12 ± 0,22 и 1,79±0,32 lg КОЕ/г соответственно, P < 0,05). Грибы рода Candida у больных НЯК высевались чаще, чем у больных БК, однако их количество при БК несколько превышало нормальные показатели (4,28 ± 0,45). Следовательно, на фоне снижения количества облигатных бактерий у больных НЯК повышается количество, удельный вес факультативной флоры, что приводит к нарушению колонизационной резистентности. Повышается частота высеваемости клебсиелл, клостридий, энтеробактера и протея.

Наличие полиморфизма TLR-3 и TLR-4 у обследованных больных ВЗК приводило к более выраженным изменениям качественного и количественного состава микрофлоры кишечника по сравнению с больными, не имеющими генетической предрасположенности. Так, у пациентов с полиморфизмом TLR-3 чаще высевались E.coli и Enterobacter, а у больных с полиморфизмом TLR-4 преобладала высеваемость Klebsiella, Proteus и Enterococcus. Качественные изменения микрофлоры при ВЗК, обусловленные генетической предрасположенностью, могут носить более стойкий характер, способствовать развитию ВЗК, рефрактерных к лечению. Данные изменения могут быть обусловлены нарушениями содержания биогенных аминов, продуцируемых микрофлорой кишечника, что усиливает кишечную моторику, секрецию слизи, провоцирует болевую импульсацию. При дисбиозе кишечника нарушается инактивирование ферментными системами микрофлоры биологически активных веществ, гистамина и серотонина. Гиперпродукция серотонина и гистамина бактериями толстого кишечника приводит к образованию избыточного количества токсических веществ, усилению пропульсивной активности кишечника, что усугубляет симптомы ВЗК. Снижение продукции гистидазы поврежденной слизистой оболочкой кишечника также приводит к увеличению концентрации гистамина в крови, развитию сенсибилизации к условно-патогенной флоре. Дисбиоз кишечника способствует развитию и поддержанию моторно-эвакуаторной дисфункции, являющейся предрасполагающим фактором возникновения кишечного дисбиоза. При прогрессировании дисбиотических процессов в слизистой оболочке прослеживаются морфологические изменения эпителия: снижение серотонинпродуцирующих ЕС-клеток, что способствует угнетению перистальтики, инфильтрирующих эпителиальный пласт эозинофилов, лимфоцитов, плазмоцитов, нейтрофилов, фибробластов стромы, уменьшается количество лаброцитов, продуцирующих гистамин, что приводит к отеку и дальнейшей инфильтрации соединительной ткани клеточными элементами [13, 14]. Возможно, это способствует формированию рефрактерных к медикаментозной терапии клинических типов ВЗК.

Заключение. Таким образом, у обследованных больных ВЗК имелась генетическая предрасположенность к нарушению микробиоценоза кишечника, связанная с изменением экспрессии toll-подобных рецепторов (TLR-3 и TLR-4). При этом сочетание полиморфизма TLR-3 с изменениями микрофлоры кишечника свидетельствует о преобладании избыточного иммунного ответа на антигены облигатных и факультативных бактерий у больных НЯК. В то же время у пациентов с БК преобладание полиморфизма TLR-4 в сочетании с наличием условно-патогенной микрофлоры в кишечнике может отражать снижение реактивности к кишечным патогенам.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Григорьев А.В. Желудочно-кишечный тракт как среда обитания бактерий. Раздел 1. Морфология желудочно-кишечного бактериального биотопа. - М.-Киев: 2004. - 95 с.
  2. Е.И. Ткаченко, А.Н. Суворова Дисбиоз кишечника: Руководство по диагностике и лечению. - СПб.: Спецлит, 2007. - 238 с.
  3. Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М. Трофические и регуляторные связи макроорганизма и микрофлоры // Клиническая медицина. - 1991. - №7. - С. 24-28.
  4. Дорофеев А.Э., Звягинцева Т.Д., Харченко Н.В. Заболевания кишечника. - Горловка: ПП «Видавництво Ліхтар», 2010. - 532 с.
  5. Ардатская М.Д. Диагностическое значение короткоцепочечных жирных кислот при синдроме раздраженного кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - №3. - С. 36-41.
  6. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника // Materia Medics. - 2003. - №2-3. - С. 2-8.
  7. Крючко Т.О. и др. Г енетичний поліморфізм Toll-подібного рецептора 4 у дітей з атопічною бронхіальною астмою / / Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология. - 2011. - №5. - С. 52-54.
  8. Толстопятова М.А., Буслаева Г.А., Козлов И.Г. Роль рецепторов врожденного иммунитета в развитии инфекционной патологии у новорожденных детей // Педиатрия. - 2009. - Т. 87, №1. - С. 115-120.
  9. Moser M. Dendritic cell regulstion of TH1/TH2 development // №t. Immunol. - 2000. - Vol. 1. - P. 199-205.
  10. Schwsrtz D. The Genetics of Innate Immunity // CHEST. - 2002. - Vol. 121. - P. 62-68.
  11. C. Msrsik, B. Jilms, C. Joukhadar et sl. The Toll-Like Receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile Polymorphisms Influence the Late Infіammatory Response in Humsn Endotoxemia // Clinicsl Chemistry. - 2005. - Vol. 51, №11. - Р. 2178-2180.
  12. B. Ferwerda, M.B. McCsll, K. Verheijen, B.J. Kullberg Functional Consequences of Toll-like Receptor 4 Polymorphisms // Mol. Med. - 2008. - Vol. 14, №5-6. - Р. 346-352.
  13. Gsrcis Rodriguez С. Toll-like receptor 4 dependent pathways ss sensors of endogenous «dsnger» signals. New evidences and potentisl therapeutic tsrgets // Inmunologis. - 2007. - Vol. 26, №4. - Р. 210-215.
  14. Medzitov R. Toll-like receptors snd innste immunity // Nsture Rev. Immunol. - 2001. - №1. - Р. 136-144.
  15. Hsrju K., Glumoff V., Hsllmsn M. Ontogeny of TLR-2, TLR-4 in mice // J. Pedistr. Res. - 2001. - №49. - Р. 81-83.
  16. Brikos C., O'Neill L.A. Signsling of toll-like receptors // Hsndb. Exp. Phsrmscol. - 2008. - V. 183. - P. 21-50.
  17. Akira S., Tskeds K. Toll-like receptors in innste immunity // Immunology. - 2005. - №17(1). - Р. 1-14.
Год: 2019
Город: Алматы
Категория: Медицина