Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике

В статье описана разработка способа индикации цитокинов в лимфоцитах, путем выявления цитокинов в лизате лимфоцитов, определяемая концентрация цитокинов выше, чем в сыворотке крови и соответствует их истинному уровню invivo на момент исследования что позволяет оценить состояние иммунной системы по цитокиновому профилю.

Важную роль в регуляции иммунного ответа при инфекциях играют цитокины, своеобразные маркеры активности иммунитета. Это медиаторы межклеточного взаимодействия, высокоактивные биологические вещества пептидной природы, основными клетками продуцентами которых являются лимфоциты. Цитокины регуляторы защитных реакций организма, они усиливают эффекторные механизмы элиминации чужеродного антигена, регулируют воспаление и регенерацию.

Цель и методы исследования: Изучали возможность оценки активности воспалительного процесса у больных трихомониазом по уровню ИФН-ү и ИЛ-4 и эффективность применения беталейкина (ИЛ-1) в лечении этих больных.

Существует способ определения концентрации цитокинов с помощью ИФА под действием митогенной стимуляции (ФГА, КонА и др.) лимфоцитов (индуцированная продукция). Когда выделенные из крови и отмытые лимфоциты инкубируют в питательной среде с добавлением митогенного стимулятора, под влиянием которого индуцируется синтез цитокинов. Через 2-3 суток исследуется надосадок. По уровню цитокинов в надосадке судят о функциональной возможности клеток. Таким способом определяется лишь резервная и потенциальная цитокиновая активность клеток.

Известен также способ определения цитокинов с помощью ИФА в сыворотке крови. Определяется цитокиновый профиль макроорганизма на момент исследования. Недостатком способа является низкая чувствительность, в связи с очень коротким (минуты) периодом их жизни из-за неспецифических (некоторые сывороточные белки) и специфических (растворимые рецепторы и антитела к цитокинам) факторов связывания. Поэтому нередко в сыворотках даже здоровых доноров определяется низкий уровень цитокинов, находящихся на грани чувствительности ИФА.

Материалы и методы исследования: Нами был разработан способ выявления цитокинов в лизате лимфоцитов (клетки продуценты цитокинов).Предварительно лимфоциты выделяют на фиколл-верографине, отмывают и лизируют. В клеточном лизате определяют цитокины. При таком подходе, определяемые цитокины не связываются и не блокируются неспецифическими и специфическими факторами сыворотки крови. Поэтому определяемая концентрация цитокинов должна быть выше, чем в сыворотке крови и соответствовать их истинному уровню invivo на момент исследования. Постановка ИФА такая же, как в контроле. Предварительно вычерчивали

калибровочную кривую, по контрольным образцам. Затем определяли соотносительный уровень цитокинов от данных полученных в ИФА. Результаты опытов по выявлению интерферона-ү представлены в таблице 1.

Таблица 1 Эффективность определения ИФН-ү в сыворотке крови и лизате лимфоцитов

Видно, что определяемый уровень цитокинов в лизате лимфоцитов эффективнее способа определения цитокинов в сыворотке крови в несколько раз (р<0,01). Однако, в некоторых случаях, при исследовании больных трихомониазом уровень ИФН-ү в сыворотке крови был таким же или даже выше уровня ИФН-ү чем в лизате лимфоцитов.

Содержание цитокинов меняется последовательно. Их синтез осуществляется в лимфоцитах и некоторых других клетках. В норме, вне обострения заболевания, в лимфоцитах есть определенное наработанное количество цитокина. Затем, по мере накопления, они выделяются во внеклеточное пространство, в кровь. Процесс этот постоянный. Таким образом, поддерживается физиологический и необходимый для нормального функционирования организма профиль цитокинов.

Значительная часть цитокинов, попадающая в кровь, связывается со специфическими и неспецифическими пептидами, поэтому часто их выявляемое количество находится на грани чувствительности ИФА тестирования. Но в лимфоцитах цитокины не связываются с пептидами крови, поэтому целесообразным следует считать изучение цитокинов в лимфоцитах, так как количественная характеристика цитокина по его содержанию в лимфоцитах, более объективна и соответствует истинной картине их спонтанной продукции.

Под влиянием некоторых факторов (вирусы, липополисахариды бактерий, митогены и т.д.), синтез провоспалительных цитокинов лимфоцитами стимулируется. Начинается более активное накопление их в клетках и выброс в кровь в большем количестве. Несмотря на частичное связывание цитокинов белками крови, их содержание в крови становится больше, чем в лимфоцитах. Известно, что интерферон-ү синтезируется в самый ранний период инфекции и относится к провоспалительным цитокинам. При использовании методов определения интерферон-ү в сыворотке крови и в лейкоцитах нам удалось обнаружить парадоксальную картину. Оказалось, что изменение соотношения ИФН-ү в лимфоцитах и сыворотке крови начинается еще в доклиническую стадию, в продромальный период инфекционного процесса (ОРЗ). Если у здоровых доноров в лизате лимфоцитов ИФН-ү существенно больше (в 2-4 раза), чем в сыворотке крови, то в самом начале инфекционного процесса (грипп), продромальный период, картина меняется. Его количество в сыворотке крови становится равным или больше чем в лимфоцитах.

Видимо, в стрессовом режиме (инфекция) из лейкоцитов начинает активно вбрасывается в кровь наработанный еще в доклинический период ИФН-ү. Это приводит к некоторому истощению или снижению количества этого цитокина в лимфоцитах. Но важно, то, что этот начальный период можно выявить, сравнивая уровень этого цитокина в сыворотке крови и лимфоцитах(таблица 2). В крови (M±m 113±16) его становится больше, чем в лимфоцитах (M±m 66±7). Меняется картина и при индуцированном определении цитокина (с ФГА). У здоровых доноров его количество выше, чем в крови, но в начале инфекционного процесса уже в крови его становится больше (55,6±15) (р<0,05). Видимо, стресс (инфекция) приводит к некоторому истощению потенциальных возможностей лимфоцитов нарабатывать провоспалительный (ИФН-ү) цитокин.

Таблица 2 Уровень интерферона-ү у доноров и больныхс ОРЗ

Уровень ИФН-ү при трихомониазе важно оценить в динамике лечения, так как высокий уровень продукции ИФН-ү ассоциируется с эффективным иммунным ответом против возбудителя инфекции и является главным медиатором клеточного иммунитета. Этот цитокин играет главную роль в качестве макрофаг-активирующего фактора стимулятора функциональной активности Т-лимфоцитов, что играет важную роль в лечении трихомониаза. Одна из основных причин фагоцитарного иммунодефицита при трихомониазе, и развитие хронической формы паразитоза обусловлена функциональным дисбалансом системы цитокинов, нарушающим межклеточные взаимодействия. Продуцентом противовоспалительного цитокина ИЛ-4 являются также лимфоциты. Было отмечено [1], что количество этого цитокина неодинаково у больных с внутрии внеклеточной локализацией бактерий, к которым относится, например псевдотуберкулез. У всех больных количество ИЛ-4 было повышено и в большей степени у больных с рецидивирующей формой псевдотуберкулеза. Причем концентрация ИФН-ү в крови была ниже, чем в контроле. Авторы определяли количественное соотношение ИФН-ү/ИЛ-4. В норме оно выше 4, при неблагоприятном течении инфекционного процесса этот показатель снижается иногда в десятки и сотни раз. По мнению авторов, этот индекс может служить прогностическим признаком течения заболевания. Так как одним из основных механизмов нарушения иммунореактивности, определяющим неблагоприятное течение псевдотуберкулеза, является гиперпродукция ИЛ-4 с одновременным угнетением синтеза ИФН-ү.Авторы использовали в комплексной терапии больных псевдотуберкулезом ронколейкин (ИЛ-2), который опосредованно, через активацию Т-лимфоцитов и NK клеток стимулирует продукцию ИФН-ү. Полученные результаты подтвердили высокую эффективность применения этого препарата в лечении рецидивирующего псевдотуберкулеза. У больных, получавших ронколейкин, достоверно сокращались длительность периода интоксикации, быстрееисчезала сыпь, явления кардиопатии. Клинический эффект был ощутимым.

ИЛ-1 (беталейкин), который мы использовали в лечении трихоманиаза, также как и ронколейкин активирует клеточный ответ, что ведет к экспрессии генов различных цитокинов (прежде всего ИФН-ү). Этот цитокин является главным медиатором развития, как местной воспалительной реакции, так и острофазового ответа на уровне организма [2]. Изучали содержание этих цитокинов у больных трихомониазом опытной (с использованием в лечении беталейкина 40 чел.) и контрольной (40 чел.) групп в начале и в конце лечения заболевания. Количество ИФН-ү в сыворотке крови у больных опытной группы и группы сравнения (контрольная группа, лечение без беталейкина) до начала лечения колебалось от 0 до 25пг/мл. Средние значения в двух группах сравнения 10,6±1,9 пг/мл. В лимфоцитах в двух группах уровень ИФН-ү колебался от 21 до 109 пг/мл. Средние значения существенно выше, чем в сыворотке крови (р<0,01) при фактически одинаковых уровнях в двух группах: в опытной -51,5±7,8 пг/мл, в контрольной -53,5±5,1 пг/мл. После лечения в двух группах отмечено увеличение ИФН-ү и в сыворотке крови и в лимфоцитах. Наиболее выраженное увеличение ИФН-ү отмечено в опытной группе. Так в сыворотке крови его количество стало больше примерно в 2 раза и достигло средних значений по группе 24,2±3,7 пг/мл (р<0,01). В лимфоцитах количество ИФН-ү увеличилось примерно в 3 раза и достигло 161,6±10,0 пг/мл (р<0,01). В контрольной группе сравнения отмечено не существенное увеличение ИФН-ү после лечения в сыворотке крови больных до 12,3±2,7 пг/мл (р>0,1) и лимфоцитах до 92,0±10,4 пг/мл (р>0,1). Показательно, что после лечения у больных в опытной группе количество ИФН-ү и в сыворотке крови, и в лимфоцитах было значимо больше, чем у больных группы сравнения (р<0,01).

Количество ИЛ-4 у больных двух групп в сыворотке крови колебалось от 0 до 68 пг/мл, при этом среднее значение в группе сравнения 15,8±5,7 пг/мл фактически не отличалось от этого показателя опытной группы 18,1±6,6 пг/мл. В лимфоцитах уровень этого цитокина колебался от 0 до 122 пг/мл, при этом средние значения группы сравнения 22,1±7,3 пг/ мл и опытной 30,1±10,6 пг/ мл групп практически не различались. После лечения отмечено снижение уровня ИЛ-4 в сыворотке крови и лимфоцитах в двух группах. Но степень снижения неодинакова. Если в контрольной группе в сыворотке крови количество ИЛ-4 снизилось только до 12,2±4,6 пг/ мл (р>0,1), а в лимфоцитах до 21,6±8,4 пг/ мл (р>0,1), то в опытной группе снижение уровня ИЛ-4 было более существенно. В крови до 2,7±1,5 пг/ мл (р<0,01), в лимфоцитах до 5,0±2,3 пг/ мл (р<0,01). После лечения у больных в опытной группе количество ИЛ-4 и в сыворотке крови, и в лимфоцитах было значимо меньше, чем у больных группы сравнения (р<0,05). Если рассматривать соотношение уровня цитокинов ИФН-ү/ИЛ4, как предлагают С.Н. Бениова, Е.В. Маркелова [1], для прогностической оценки течения инфекции, то лучшие показатели также в опытной группе. В группе сравнения и опытной группе до лечения это соотношение по количеству цитокинов в крови было примерно равным 0,7 и 0,6 соответственно. После лечения это соотношение в группе сравнения стало равным 1, а в опытной 8. Видно, что значительно более высокие цифры в 8 раз превосходящие показатель в группе сравнения (р<0,001). Интересно было просмотреть этот показатель по содержанию цитокинов в лимфоцитах. В группе сравнения этот коэффициент был равен 2,7, в опытной 1,7. После лечения в группе сравнения показатель вырос до 4,7, а в опытной до 32. Разница в росте также существенна, как и в сыворотке крови в 7 раз (р<0,001).Сравнивали показатели клинических проявлений заболевания и результаты объективного осмотра больных в двух группах. При этом обнаружено достоверное улучшение динамики клинических проявлений в группе, пролеченной беталейкином. Так количество больных с выраженными улучшениями в опытной группе составило 28 (70,0±4,4 %), а в контрольной группе сравнения -19(47,5±4,9 %) (р<0,001). При трихомониазе нередко развивается хронизация процесса. Не вызывает сомнений иммунодепрессивность патогенетических механизмов формирования исходов заболевания. Считается, что определяющую роль в исходе некоторых инфекций играет дисбаланс, развивающийся на уровне именно фагоцитирующих клеток. Установлено, что при этом фагоцитоз носит незавершенный характер. Сохранение в течение длительного времени незавершенности фагоцитоза сопровождается длительным течением инфекции с обострениями и рецидивами, что также характерно для хронизации трихомониазной инфекции [3, 4]. Но ведущая роль в активации и регуляции процессов фагоцитоза играют цитокины

[5].Количественные изменения основных прои противовоспалительных цитокинов ИФН-ү и ИЛ-4 в крови и лимфоцитах, говорят о существенно более выраженном фагоцитозе и активном процессе элиминации паразита у больных опытной группы и, в конечном итоге, их более быстром выздоровлении.

Таким образом, разработан способ индикации цитокинов в лимфоцитах, что значительно повышает чувствительность их обнаружения и позволяет реально оценить состояние иммунной системы по цитокиновому профилю. Уровень ИФН-ү в крови и лимфоцитах растет, ИЛ-4 падает, а количественное соотношение ИФН-ү/ИЛ-4 восстанавливается существенно быстрее у больных трихомониазом при дополнительном применении в лечении беталейкина, что ведет к более выраженному и полноценному ответу иммунной системы на инфекцию и болееэффективному результату лечения трихоманиаза.

Вывод: важную роль в регуляции иммунного ответа при инфекциях играют цитокины, своеобразные маркеры активности иммунитета. Разработан способ индикации цитокинов в лимфоцитах, что значительно повышает чувствительность их обнаружения и позволяет реально оценить состояние иммунной системы по цитокиновому профилю. Уровень ИФН-ү в крови и лимфоцитах растет, ИЛ4 падает, а количественное соотношение ИФН-ү/ИЛ-4 восстанавливается существенно быстрее у больных с трихоманиазом принимавших в качестве дополнительного лечения ИЛ-1 (беталейкин). Это ведет к более выраженному и полноценному ответу иммунной системы на инфекцию и, следовательно, активной и полной элиминации паразита у этих больных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бениова С.Н., Маркелова Е.В. Иммунокоррекция рецидивирующего течения псевдотуберкулеза у детей // Цитокины и воспаление. 2003. Т. 2, № 3. С. 13-17.
2. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. 2003. Т. 2, № 3. С. 20-35.
3. Беседнова Н.Н., Сомов Г.П. Рецидивы псевдотуберкулеза и их прогнозирование // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. № 2. С. 52-55.
4. Eitel J., Dersch P. The YadA protein of Yersinia psevdotuberculosis mediates high-efficiency uptake into human cells under environmental conditions in which invasin is repressed // Infect. Immun. 2002. Vol. 70, N 9. P. 4880-4891.
5. Симбирцев А.С. Интерлейкин-8 и другие хемокины // Иммунология. 1999. № 4. С. 9-14.