Сравнительная оценка методик идентификации сердечных гликозидов в лекарственном растительном сырье

Проведена сравнительная оценка требований к качеству фармакопей мира к лекарственному растительному сырью, содержащему сердечные гликозиды, в рамках параметра «Идентификация». На основании результатов сравнительного анализа монографий серДечные гликозиДы конваллатоксин и цимарин установлены как маркерные соединения Для лекарственного растительного сырья адониса тяньшанского. Отобраны 5 фармакопейных методик метода тонкослойной хроматографии из французкой и немецкой гомеопатической фармакопей Для апробации и валиДации.

Актуальность. Сердечные гликозиды представляют собой большую группу соединений природного происхождения, которые отличаются структурой, состоящей из стероидного ядра с пяти(карденолиды) или шестичленным (буфадиенолиды) лактонным кольцом и сахарного остатка [1]. Вот уже более 200 лет сердечные гликозиды применяют при лечении хронической сердечной недостаточности, активность связана с их избирательным действием на внутриклеточный транспорт ионов Na+, K+ и Ca2+ [2, 3]. Основным источником получения сердечных гликозидов является лекарственное растительное сырье [4], к которым также относятся растения рода Adonis L. Общеизвестно, что род включает в себя 32 вида однолетних и многолетних растений, широко распространенных в умеренных температурных зонах Азии и Европы, а также в малой степени на юго-западе Азии, севере Африки и Средиземноморском регионе [5].

В настоящее время в государственном реестре Республики Казахстан (РК) [6] зарегистрировано 3 лекарственных препарата сердечных гликозидов и имеются фармакопейные монографии на фармацевтические субстанции «Дигоксин» и «Дигитоксин» в Государственной Фармакопее Республики Казахстан (ГФ РК) [7]. Однако, в ГФ РК отсутствуют частные фармакопейные статьи на лекарственное растительное сырье (ЛРС), содержащее сердечные гликозиды.

В рамках научно-исследовательской программы «Этнофармацевтическое изучение флоры Казахстана № 0115РК0245» в Школе Фармации АО «Национального медицинского университета» проводится исследование вида адониса тяньшанского (Adonis tianschanica (Adolf.) Lipsch.), который представляет значительный научнопрактический интерес как перспективный источник сердечных гликозидов, произрастающий на территории Республики Казахстан и являющийся эндемиком [8]. Оценка требований к качеству и безопасности лекарственного растительного сырья проводиться на основании аналитических нормативных документов (АНД РК) и монографий фармакопей, признанных действующими на территории РК (Приказ Комитета фармации МЗ РК от 11 февраля 2004 г. № 21).

Целью исследования является сравнительная оценка требований к качеству фармакопейного лекарственного растительного сырья, содержащего сердечные гликозиды, в рамках параметра «Идентификация».

Материалы и методы. В качестве первоначального этапа, согласно методологии разработки монографий [9], проведена сравнительная оценка фармакопейных частных статей следующих фармакопей: Государственная Фармакопея Республики Казахстан (ГФ РК), Европейская фармакопея (European Pharmacopoeia, EP), Фармакопея Соединенных Штатов Америки (United States Pharmacopeia, USP), Британская фармакопея (British Pharmacopoeia, BP), Французская фармакопея (Pharmacopee Fran^aise, PF), Фармакопея Украины (Державна Фармакопея Украіни, ДФУ), Государственная Фармакопея Российской Федерации (ГФ РФ), Государственная Фармакопея Союза Советских Социалистических Республик (ГФ СССР), Государственная Фармакопея Республики Беларусь (ГФ РБ), Японская фармакопея (Japanese Pharmacopoeia, JP), Фармакопея Китайской Народной Республики (Pharmacopoeia of The People's Republic of China, PPRC), Индийская Фармакопея (Indian Pharmacopoeia, IP), Немецкая гомеопатическая фармакопея (German Homoeopathic Pharmacopoeia, GHP), Американская гомеопатическая фармакопея (The American Homoeopathic Pharmacopoeia, AHP), Британская гомеопатическая фармакопея (British Homoeopathic Pharmacopoeia, BHP), Гомеопатическая фармакопея Индии (Homoeopathic Pharmacopoeia Of India, HPI). Объектами получения сердечных гликозидов определены следующие фармакопейные виды: Adonis vernalis, Convallaria majalis, Convallaria transcaucasica Utkin ex Grossh., Convallaria keiskei Mig., Digitalis purpurea, Digitalis grandiflora Mill., Strophanthus gratus, Strophanthus hispidis DC, Nerium oleander, Urginea maritima.

Результаты и их обсуждение. Согласно требованиям ГФ РК идентификация лекарственного растительного сырья проводиться методами: макроскопии, микроскопии, идентификации биологически активных веществ (тонкослойная хроматография ТСХ, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ и качественные реакции). Фармакопейный анализ показал, что сердечные гликозиды как биологически активные вещества идентифицируют при помощи ТСХ. Сравнительная оценка фармакопейных методик идентификации сердечных гликозидов методом ТСХ представлена в таблице 1.

Таблица 1 Сравнительный анализ фармакопейных методик идентификации сердечных гликозидов методом ТСХ

Наименование ЛРС

Наименование Фармакопеи

Описание методики

Испытуемый раствор

Раствор сравнения

Вид ТСХ пластинки

Подвижна я фаза

Объем наносим ой пробы

Фронт подви ж-ной фазы

Проявители

Описание хроматограммы

Adonis vernalis

о

из си е

и-

1,0 г измельченного сырья, 20 мл спирта (50%, об/об) Р, 10 мл раствора 100 г/л свинца (II) лцетата Р, 30 мл хлороформа Р, 1 г полиамида для колоночной хроматографии Р, 2 г натрия сульфата безводного Р, 31 мл смеси хлороформ Р метанол Р (50:50, об/об)

5 мг дигитоксина

Р в 1 мл смеси хлороформ Р метанол Р (50:50, об/об).

со слоем силикаге ля G Р

хлороформ Р толуол Р метанол Р (80:10:10, об/об/об)

20 мкл испытуе мого раствора (ИР) и 10 мкл раствора сравнен ия (РС) в виде полос

не менее 15 см от линии старта

сушка на воздухе реактив ванилина Р просматривают при дневном свете

зона зеленого цвета (цимарин), расположенная немного выше зоны дигитоксина на хроматограмме РС.

си X из

10 мл матричной настойки, 10 мл этанола (50 % об/об) Р, 10 мл раствора ацетата свинца Р, 30 мл этилацетата, метиленхлорида Р, безводный сульфат натрия Р, 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об).

2,5 мг конваллатоксина PN и

2,5 мг цимарина PN в 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об).

со слоем силикаге ля Р

вода Р метанол Р этилацетат Р (8:11:81 об/об/об)

50 мкл

ИР и 10 мкл РС

не менее 10 см от линии старта

сушка на воздухе смесь раствора кислоты динитробензойной Р разбавленного раствора натрия гидроксида Р (50:50, об/об). Просматривают при дневном свете

две желтые зоны, фиолетовая зона (конваллатоксина), желтая зона, фиолетовая зона (цимарин), желтая зона.

г?

Си си

20 мл матричной настойки, 5 мл раствора ацетата свинца Р, 30 мл метиленхлорида Р, безводный сульфат натрия Р, 0,5 мл 96% ного этанола Р.

10 мг конваллаток сина Р и 10

мг цимарина Р в 40 мл 96 % этанола Р.

со слоем силикаге ля Р (5

40 мкм) или (2-10 мкм).

вода Р метанол Р этилацетат Р (8:11:81 об/об/об)

40 мкл (или 20 мкл) в виде полосок

не менее

10 см

(или 7 см) от линии старта

сушка на воздухе раствор кислоты динитробензойной Р, 100 г/л раствор калия гидроксида Р в метаноле Р,

Просматривают при дневном свете

фиолетовая зона (конваллатоксин), фиолетовая зона, фиолетовая зона (цимарин)

Convallaria majalis

ГФ РФ [13]

2,0 г листьев, травы или цветков ландыша, 102 мл спирта 70 %, 1мл свинца ацетата раствора 10 %, 5 мл воды, 70 мл смеси хлороформ-спирт 96% (8:2), 3,0 г натрия сульфата безводного

 

со слоем силикаге ля Р с флуоресц ентным индикат ором

хлороформ

ацетон метанол (6:2:2)

50 мкл

около

80 90

%

длины пласти нки от линии старта

сушка на воздухе раствор ванилина 1 % в растворе кислоты хлорной 10 %

не менее 3 зон адсорбции малинового цвета

CU

X

С

10 мл матричной настойки, 20 мл воды Р,

10 мл раствора ацетата свинца Р, 30 мл этилацетата Р, 1 мл смеси из этилацетата Р и метанола Р (50:50, об/об).

2,5 мг конваллаток сина РN в 1

мл смеси из этилацетата Р и метанола Р (50:50, об/об).

со слоем силикаге ля Р

вода Р, метанол Р, этилацетат

Р (8:11:81 об/об/об)

30 мкл

ИР и 10 мкл РС

не менее 10 см от линии старта

сушка на воздухе 10 мл смеси раствора кислоты динитробензойной Р и разбавленного раствора натрия гидроксида Р (50:50, об/об). Просматривают при дневном свете.

зона от краснофиолетового до коричнево-фиолетового, красно-фиолетовая зона (конваллатгоксин), красно-фиолетовая зона

г?

ь CU

10 мл матричной настойки, 5 мл раствора ацетата свинца Р, 15 мл метиленхлорида Р, безводным сульфатом натрия Р, 1 мл 70% об/об этанола Р.

2 мг конваллаток сина Р и 5 мг дигитоксина Р растворяют в 10 мл метанола Р.

со слоем силикаге ля CCM Р.

вода Р, метанол Р, этилацетат Р (8:11:81 об/об/об).

40 мкл в полосках

не менее

10 см

сушка на воздухе

10 г/л раствор кислоты динитробензойной Р в смеси равных частей метанола Р и 2 М калия гидроксида. исследуют при дневном свете.

фиолетовая зона, фиолетовая зона (конваллатоксин)

Digitalis purpurea

CU ш

1,0 г измельченного сырья, смесь 20 мл спирта (50 %, об/об) Р и 10 мл раствора свинца (II) aцeтата Р. 30 мл хлороформом Р, натрия сульфат безводного Р, 1 мл смеси хлороформа Р и метанола Р (50:50, об/об).

5 мг ФСО пурпуреагли козида А, 2 мг ФСО пурпуреагли козида В, 5 мг дигитоксина Р и 2 мг гитоксина Р в смеси смеси хлороформа Р и метанола Р (50:50, об/об).

со слоем силикаге ля G Р

вода Р метанол Р

этилацетат

Р (7,5: 10:75, об/об/об).

по 20 мкл в виде полос длиной

20 мм и шириной около 3 мм

не менее 10 см от линии старта

сушка на воздухе смесь раствора 10 г/л хлорамина Р и раствора 250 г/л кислоты трихлоруксусной Р (2:8) в 96 % спирте Р.

просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

флуоресцирующая зона светло-синего цвета (пурпуреагликозид В), флуоресцирующая зона коричневато-желтого цвета (пурпуреагликозид А),

флуоресцирующая зона светло-синего цвета (гитоксин), флуоресцирующая зона коричневато-желтого цвета(дигитоксин)

и?

си CQ

о

из си е

и-

o'

>> е ч

си

X о

10 мл матричной настойки, 20 мл воды Р,

10 мл раствора ацетата свинца Р, 30 мл этилацетата Р, 1 мл смеси из этилацетата Р и метанола Р (50:50, об/об).

5 мг дигитоксина

Р и 5 мг ланатозида С

РN в 1 мл метанола Р

со слоем силикаге ля Р

вода Р, метанол Р, этилацетат

Р (8:11:81 об/об/об)

30 мкл

ИР и 10 мкл РС

не менее

15 см от линии старта

сушка на воздухе свежеприготовленный

30 г/л раствор хлорамина Т Р и 250 г/л раствора трихлоруксусной кислоты Р (2:8) в этаноле Р

просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Три флуоресцирующии зоны сине-зеленого цвета, флуоресцирующая зона желто-зеленого цвета (дигитоксин), флуоресцирующая зона желто-коричневого цвета, две флуоресцирующии зоны желто-зеленого цвета.

Nerium oleander

си

X

О

Матричная настойка

5 мг дигитоксина

Р и 5 мг ланатозида С

РN в 1 мл метанола Р

со слоем силикаге ля Р

вода Р, метанол Р, этилацетат

Р (8:11:81 об/об/об)

100 мкл

ИР и 10 мкл РС

не менее 15 см от линии старта

сушка на воздухе смесь раствора 10 г/л хлорамина Р и раствора 250 г/л кислоты трихлоруксусной Р (2:8) в 96 % спирте Р. Просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

флуоресцирующая зона желтого цвета, флуоресцирующая зона синего цвета, флуоресцирующая зона коричневого цвета, флуоресцирующая зона синего цвета, флуоресцирующая зона желтого цвета, две флуоресцирующии зоны синего цвета.

Urginea maritima

си

X

О

0,500 г измельченного сырья, 60 мл петролейного эфира Р, 130 мл 70% об/об этанола Р

20 мг оуабаин РН в

10 мл метанола Р

со слоем силикаге ля Н Р

Кислота уксусная ледяная Р, бутанол Р, вода Р (10:40:50 об/об/об)

100 мкл

ИР и 50 мкл РС

не менее 15 см от линии старта

сушка на воздухе кислота серная Р, просматривают при дневном свете

желтовато-зеленая зона (оуабаин)

Strophanthus gratus

си

X

О

10 мл матричной настойки, 20 мл вода Р, 10 мл ацетата свинца Р,

10 мл раствора гидрофосфата натрия Р, 90 мл смеси этиацетата Р и пропанола Р (5:1), 2 г натрия сульфата безводного Р, 1 мл метанола Р (50:50, об/об)

5 мг ланатозида С РN и 5 мг просциллари дина РN в 1 мл смеси этилацетата Р и метанола Р (50:50, об/об)

со слоем силикаге ля Н Р

вода Р, метанол Р, этилацетат

Р (8:11:81 об/об/об)

30 мкл

ИР и 10 мкл РС

не менее 15 см от линии старта

сушка на воздухе раствор анисового альдегида Р, Просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

желтовато-зеленая зона (сциллирозид), желтовато-коричневая зона

дополнительные коричневые зоны

В качестве стандартного образца сравнения при определении сердечных гликозидов методом ТСХ используют следующие сердечные гликозиды в зависимости от вида ЛРС:

Adonis vernalis: дигитоксин, конваллатоксин, цимарин; Convallaria majalis: дигитоксин, конваллатоксин;

Digitalis purpurea: пурпуреагликозида А, пурпуреагликозида В, дигитоксина, гитоксина;

Nerium oleander: дигитоксина, ланатозид С;

Urginea maritime: оуабаин; Strophanthus gratus: ланатозид С, просцилларидин.

Из всех представленных в таблице 1 методик наиболее приемлемыми для дальнейших исследований, апробации и валидация, являются методики описанные во Французской [12] и Немецкой гомеопатической фармакопеях [11] для лекарственного растительного сырья Adonis vernalis и Convallaria majalis. Возможна апробация и методики, описанной в Государственная Фармакопея Республики Беларусь [10], однако в качестве стандартного образца наиболее целесообразно исследовать цимарин и конваллатоксин.

На основании представленных в таблице 1 методик для апробации выбраны 5, как наиболее оптимальные, в которых маркерами являются конваллатоксин и цимарин. Необходимо отметить, что в 4 из них подвижные фазы идентичны и пробоподготовка испытуемого раствора и раствора сравнения, система проявителей имеет схожие элементы и параметры.

Методики для апробации будут иметь следующую интерпретацию, однако пробоподготовка, подвижная фаза, вид пластинки для хроматографии, фронт подвижной фазы, приготовление проявителя и описание хроматограммы будут соответствовать параметрам, представленным в таблице 1.

Метод тонкослойной хроматографии (2.2.27) [7] в

следующей интерпретации: Испытуемый раствор. 1 г измельченной субстанции добавляют в 20 мл спирта этилового (50%, об/об) Р и 10 мл раствора свинца (II) ацетата Р. Кипятят в течении 2 мин, охлаждают и центрифугируют. Надосадочную жидкость декантируют и перемешивают с 30 мл этилацетата Р и фильтруют. Фильтрат выпаривают досуха и растворяют в 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об). Раствор сравнения. 5 мг СО ГФ РК конваллатоксина и 5 мг СО ГФ РК цимарина растворяют в 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об). На линию старта ТСХ пластинки со слоем силикагеля Р наносят 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора сравнения в виде полос. Пластинку помещают в камеру с системой растворителей вода Р метанол Р этилацетат Р (8:11:81, об/об/об). Когда фронт растворителей пройдет 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе, опрыскивают смесью раствора кислоты динитробензойной Р разбавленного раствора натрия гидроксида Р (50:50, об/об) и просматривают при дневном свете. На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться две желтые зоны между линей старта и конваллатоксина, фиолетовая зона (конваллатоксина), желтая зона над ней, на которую может накладываться слабая, едва отделенная фиолетовая зона, фиолетовая зона (цимарин) и желтая зона может присутствовать над цимарином.

При идентификации сердечных гликозидов также можно применять и качественные реакции, представленные ниже. Методика 1. 5 мл хлороформного извлечения приготовленного как указано выше при приготовлении испытуемого раствора, выпаривают досуха на водяной бане. К остатку прибавляют 2 мл раствора кислоты динитробензойной Р и 1 мл 1 М раствора натрия гидроксида. В течение 5 мин появляется красноватофиолетовое окрашивание.

Методика 2. 5 мл хлороформного извлечения, полученного как указано выше, выпаривают досуха на водяной бане. К остатку прибавляют 3 мл раствора ксантеидрола Р и нагревают на водяной бане в течение 3 мин. Появляется красное окрашивание.

Выводы:

На основании сравнительного анализа частных статей фармакопей мира, установлено содержание монографий на лекарственное растительное сырье сердечных гликозидов в следующих из них: Европейская фармакопея (European Pharmacopoeia, EP), Фармакопея Соединенных Штатов Америки (United States Pharmacopeia, USP), Британская фармакопея (British Pharmacopoeia, BP), Французская фармакопея (Pharmacopee Fran^aise, PF), Фармакопея Украины (Державна Фармакопея Украіни, ДФУ), Государственная Фармакопея Российской Федерации (ГФ РФ), Государственная Фармакопея Союза Советских Социалистических Республик (ГФ СССР), Государственная Фармакопея Республики Беларусь (ГФ РБ), Немецкая гомеопатическая фармакопея (German Homoeopathic Pharmacopoeia, GHP), Американская гомеопатическая фармакопея (The American Homoeopathic Pharmacopoeia, AHP), Британская гомеопатическая фармакопея (British Homoeopathic Pharmacopoeia, BHP), Гомеопатическая фармакопея Индии (Homoeopathic Pharmacopoeia Of India, HPI).

Маркерными соединениями сердечных гликозидов лекарственного растительного сырья адониса тяньшанского для тонкослойной хроматографии определены конваллатоксин и цимарин.

Изучено 11 фармакопейных методик метода ТСХ, из которых отобрано 5 методик для апробации и валидации на лекарственном растительном сырье адониса тяньшанского (Adonis tianschanica (Adolf.) Lipsch.).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. El-Seedi HR. Cardenolides: Insights from chemical structure and pharmacological utility, Pharmacological Research // Pharmacological Research. 2019. Vol. 141. P. 123-175.
  2. Pongrakhananon V. (May 9th 2013). Anticancer Properties of Cardiac Glycosides, Cancer Treatment Conventional and Innovative Approaches, Leticia Rangel, IntechOpen, DOI: 10.5772/55381. Available from URL: https://www.intechopen.com/books/cancertreatment-conventional-and-innovative-approaches/anticancer-properties-of-cardiac-glycosides
  3. Беловол А. Н. Сердечные гликозиды в лечении сердечной недостаточности // Кровобіг та гемостаз. 2012. №3(4). С. 99-105.
  4. Муравьева Д.А. Фармакогнозия: Учебник. М.: Медицина, 2002. С. 226-251.
  5. Lee CH. A Palynotaxonomic Study of Korean Adonis (Ranunculaceae) // Journal of Plant Biology. 2004. №47(4). P. 383-390.
  6. Государственном реестре ЛС, ИМН и МТ РК. [Электронный ресурс]Режим доступа URL: http://www.ndda.kz/category/Gosudarstvennyi_reesttr
  7. Государственная Фармакопея Республики Казахстан: в 3 т. Алматы: Издательский дом «Жибек Жолы», 2008. Т. 1. 592 с.
  8. Орынбекова С.О. Перспективное лекарственное растение Adonis tianschanica (Adolf.) Lipsch // Инновации в здоровье нации: VI Всерос. науч.-практич. конф. с междунар. уч. (14-15 ноября, 2018). СПб.: 2018. С. 268-270.
  9. Тулегенова А.У. Концепция введения монографий на лекарственные препараты в Государственную фармакопею Казахстана // Фармация Казахстана. 2008. №8. С. 8-12.
  10. Государственная фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т. 2. Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственное растительное сырья / / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под. общ. ред. А. А. Шерякова. Молодечно: «Типография «Победа», 2008. 472 с.
  11. German Homoeopathic Pharmacopoeia // Medpharm Scientific Publishers. 2015. Vol.11. 367 р.
  12. Pharmacopee fran^aise. 2012. Vol.11. 248 р.
  13. Государственная фармакопея Российской Федерации. Издание XIV. М.: «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2018. 7020 с.
  14. European Pharmacopoeia. 8th edition. Council of Europe. Strasbourg Cedex, France: 2013. 549 р.
  15. British Pharmacopoeia / The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA). London: 2014. 238 р.
  16. Державна Фармакопея Украіни / Державне підприемство «Украінський науковий фармакопейний гонтр якості лікарських засобів». 1-е вид. Доповнення 4. Харків: Державне підприемство Украінський науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів». 2011. — 540 с.
Год: 2019
Город: Алматы
Категория: Медицина
loading...