Компонентный состав и антивирусная активность эфирного масла artemisia issayevii rzazade

В условиях увеличения вирусных инфекций в патологии человека, повышенную актуальность приобретает поиск новых лекарственных средств вирулицидного действия. Вирулицидный эффект свойствен прежде всего полифенолам, флавоноидам, сапонинам и эфирным маслам. Эфирные масла различных видов рода Artemisia L. широко используются как дезинфицирующее, противопаразитарное, ранозаживляющее, фунгицидное средство, а также для ароматизации пищевых продуктов, в парфюмернокосметической и медицинской промышленности.

Впервые приведены результаты исследования компонентного состава и антивирусной активности эфирного масла эндемичного вида ArtemisiaissayeviiRzazade. Установлено, что спиртово-водный раствор эфирного масла указанного вида полыни подавляет цитопатическое действие неполиоэнтеровирусов в культуре клеток на 50% в 72 пробах, на 25% в 40 и на 75% в 13-ти пробах. Выявлена антивирусная активность в нативной форме спиртово-водного раствора эфирного масла ArtemisiaissayeviiRzazade.

Основными компонентами эфирного масла Artemisiaissayevii являются (в%) камфора 37 и 1,8 цинеол 31. Дальнейшей целью исследования было изучение действия эфирного масла, разведенного в 10-1,10-2 10-3, 10-4,10-5 степени на нейтрализацию цитопатическое действия неполиоэнтеровирусов в первичной клеточной культуре.

Введение.

Виды рода (Artemisia L.) широко распространены во всех географических и экологических зонах. Род включает более чем 500 видов на Земном шаре. В пределах СНГ наиболее распространены европейские, кавказские и центральноазиатские виды полыни. Полынь, как доказано многими исследователями, богата эфирными маслами, которые могут быть применены в народной и традиционной медицине в качестве антибактериальных, противораковых, противовоспалительных, противоязвенных, противовирусных, спазмолитических и других средств [1, 2, 3, 4, 5].

Эфирные масла различных видов рода Artemisia L. широко используются как дезинфицирующее, противопаразитарное, ранозаживляющее, фунгицидное средство, а также для ароматизации пищевых продуктов, в парфюмернокосметической и медицинской промышленности [6,7, 8, 9, 10, 11, 12].

Нашими исследованиями на основе сравнительного изучения сесквитерпеновых лактонов представителей рода полынь для флоры Азербайджана выявлены 42 вида полыни.

В обширном арсенале лечебных средств, применяемых в настоящее время в мировой практике для профилактики и лечения заболеваний, около треть составляют препараты растительного происхождения [1, 13, 14].

Вообще, большинство растений в целом или отдельные их части используются для приготовления галеновых и нео- галеновых препаратов.

В условиях увеличения вирусных инфекций в патологии человека, повышенную актуальность приобретает поиск новых лекарственных средств вирулицидного действия. Вирулицидный эффект свойствен прежде всего полифенолам, флавоноидам, сапонинам и эфирным маслам. Установлено вирулицидное действие эфирных масел, выделенных из некоторых видов полыни, мяты, эвкалипта и кедры на вирусы Коксаки А 18 и 20 [4, 12,15].

Имеются также данные японских ученых об ингибирующем действии галлатэпигаллокатехина из зеленого чая и дигаллатеофлавина из черного чая на развитие ротавирусов и энтеровирусов в культуре клеток почек обезьяны линии МА104 [13, 16].

Материал и методы исследования.

Объектом исследования являлось эфирное масло, полученное из надземной части ArtemisiaissayeviiRzazade, собранной в фазе бутонизации в окрестностях с. БичанакШахбузского района Нахичеванской АР Азербайджанской Республики. Эфирное масло получено методом гидродистилляции по Клевенджеру. Компонентный состав образцов эфирного масла анализировали методом газовой хроматографии и хромато- масс-спектрометрии на приборе Agilent 6890N с масс- спектрометрическим детектором Agilent 5978N [12].

Использовалась капиллярная кварцевая колонка DB-XLB FSC (30 м ' 0.25 мм) с газом-носителем гелием. Скорость подачи 1 мл/мин. Газохроматографическую колонку выдерживали при температуре 40°С в течение 10 мин с программированием температуры до 240°C со скоростью изменения температуры 2°С/мин, и затем выдерживали в изотермическом режиме в течение 10 мин. Режим ввода пробы - с делением потока. Объем пробы - 1 мкл. Температура испарителя - 250°C. Масс-спектры записывались в диапазоне m/z 10-425. Процентный состав эфирного масла вычисляли по площадям пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными компонент эталонных масел и чистых соединений, если они имелись, и с данными библиотек масс-спектров (Wiley, 7th edition (390 тыс. спектров), NIST 02 (175 тыс. соединений [12].

Исследования биологической активности эфирного масла велись двухэтапно. На первом этапе изучалось влияние эфирного масла на нормальные клетки без воздействия вирусов. Затем изучалось действие различной степени разведения (10-1 -10-5) эфирного масла на нейтрализацию цитопатического действия вирусов [16, 17, 18].

На втором этапе как контроль бралась питательная среда 199. Исследования велись invitro на первичной культуре, клеток. фибробластов 6-8 недельного человеческого эмбриона, приготовленной методами Y.Yaunger (1959) и E. Dosser (1959) [16].

Для приготовления первичной культуры фибробластов человеческого эмбриона брался материал 6-8 недельного человеческого эмбриона из родильного дома.

Материал взятый из роддома сразу фиксировался в бычьей сыворотке и помещался в стерильные флаконы с антибиотическим гидролизатомлактольбумина. Перед трипсинизацией ткань переносят в чашки Петри с добавлением антибиотика и отмывают от слизи, плацента и от кровяных сгустков.

Кожа и мышцы 6-8 недельных эмбрионов отделяются для дальнейшей работы, головы 8 недельных эмбрионов изолируются, а тело берется для трипсинизации. Ткань помещают в стерильную посуду, тонко измельчают ножницами до жижеобразной массы для дальнейшей трипсинизации в колбе обьемом 0,5 литр. 2-3 раза ткань промывают раствором Хенкса и добавляют 300 мл рабочего раствора трипсина. Меняя раствор трипсина 4-5 раз ведут поэтапную трипсинизацию отделяя клетки друг от друга. Если тканевая масса значительна, то повторно ведут трипсинизацию в течение 20 минут. После трипсинизации для полного разделения клеточных фрагментов добавляют гидролизатлактольбумина.

Скорость разделения тканевых эмбрионов на клеточные фрагменты зависит от срока эмбрионов, например 6-7 недельные эмбрионы быстро разделяются при поэтапной трипсинизации.

Смесь с остатком клеток, трипсина и гидролизаталактальбумина для нейтрализации трипсина переносим во флакон с и центрифуригуруем 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочная жидкость выбрасывается, осадок с малым количеством питательной среды ресуспензируется, фильтруется через 2-х слойную марлю. Для подсчета клеток образец переносится в счетную камеру Горяева. Для получения однородной массы рабочий образец клеток человеческого эмбриона готовится в количестве 700 тыс. - 1 млн. в/мл, а для цитологических исследований 150300 млн./1 мл. Для достижения пика митотической активности клетки человеческого эмбриона берутся после 72 часов после посева.

Результаты и обсуждение.

Из эфирного масла ArtemisiaissayeviiRzazade были выделены следуюшие компоненты: 1-октен-3-ол-0.25%, О-Цимол-1.64, 1,8 Цинеол- 31, 4 метил- 1(1метил-этил) бицикло [3.1.0] гексан-3-он-7.41,Туйон-3.47,п-Мент-2-ен-1ол-2.56, камфора 37, 4 метил-1(метил этил-)-3-циклогексен-1ол-1.90 и др.

Из выше представленных данных видно что основными компонентами эфирного масла ArtemisiaissayeviiRzazade являются (в%) камфора 37 и 1,8 цинеол 31. Дальнейшей целью исследования было изучение действия эфирного масла, разведенного в 10-1,10-2 10-3, 10-4,10-5 степени на нейтрализацию цитопатического действия неполиоэнтеровирусов в первичной культуре клеток.

На первом этапе исследований биологической активности выявлено, что эфирное масло в нативнам виде и в разведениях 10-1 -10-4 оказывает токсическое действие на нормальные клетки, а 10-5 разведение даже после 72 часов экспозиции не оказывает токсического действия (таблица 1).

Таблица 1 - Результаты влияния эфирного масла из ArtemisiaissayeviiRzazadeinvitro

Примечание: «-» не оказывает токсическое действие; «+» оказывает токсическое действие.

На втором этапе было изучено антивирусное действие нативного и разведенного 10-4 и 10-5 эфирного масла на зараженный вирусом патологический материал в виде фекальной суспензии. В виде контроля была взята среда 199.

Опыты проводились invitro при температуре 37°С.

Результаты опытов на втором этапе приведены в таблице 2.

Таблица 2 — Р езультаты вирулицидного действия эфирного масла ArtemisiaissayeviiRzazade в первичной культуре к леток

Эфирное масло (10-5) Подавление ЦПД в культуре клеток 25% 50% 75%

Пробы (n=125) 40 72 13

Как видно из таблицы 2, эфирное масло Artemisiaissayevii в разведении 10-5 нейтрализует цитопатическое действие в первичной клеточной культуре на 25% и 50%. Полученные результаты позволяют рекомендовать эфирное масло Artemisiaissayevii в профилактических целях [12].

Эфирное масло в 72 случаях на 50%, в 40 случаях на 25% и в 13 случаях на 75% нейтрализовало цитопатическое действие неполиоэнтеровирусов.

Заключение.

Таким образом, проведенные исследования позволяют нам прийти к заключению о том, что спиртово-водное разведение эфирного масла из ArtemisiaissayeviiRzazade в разведении 10 - 5 обладает антивирусной активностью и перспективно для дальнейшего исследования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сирота И..Б. Антиоксидантное действие арглабина в комплексном лечении распространенного рака молочной железы. Министерство образования и науки Республики Казахстан Институт фитохимии. - Алматы: Гылым, 2004. - С. 247-257.
2. Lindegardh N., Tarning J., Toi P.V. et al. Quantification of artemisinin in human plasma using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry // Thailand. J. Pharm. Biomed. Anal. - 2009. - Vol. 49, №3. - Р. 768-773.
3. Lesiak K., KoprowskaK,.Zalesna I. et al. Parthenolide, a sesquiterpene lactone from the medical herb feverfew, shows anticancer activity against human melanoma cells in vitro // Melanoma Res. - 2010. - vol. 20, №1. - Р. 21-34.
4. Алескерова А. Н., Асадова А. И., Рустамова Л.И., Ибрагимова С.И. Гейдарова Ф.Н. Джангирова И..Р. Исследование биоэкологических особенностей, эфирномасличности и антивирусной активности вида ArtemisiafragransWilld // Гигиена, Эпидемиология и Иммунобиология. - Алматы: 2015. - №4. - С. 120-126.
5. Алескерова А.Н., Сулейманова С.Ф., Серкеров С.В., Ибрагимова С.И., Рустамова Л.И., Гусейнова Ф.И. Компонентный состав эфирного масла ArtemisiaIssayevii и его антимикробная активность // Гигиена, эпидемиология Жене Иммунобиология. - Алматы: 2016. - №2. - С. 28-34.
6. Чобанов Р.Э., АлескероваА.Н.,Джанахметова Ш.Н., Сафиева Л.А. Экспериментальная оценка антипаразитарных свойств эфирных масел некоторых видов Artemisia L. (Asteraceae) флоры Азербайджана. Санкт-Петербург «Наука» // Растит. Ресурсы. - 2004. - Т. 40. - С. 94-98.
7. Пак Р.Н., Бейсенбаева А.А., Сеидахметова Б.Б., Атаханова Г.А., Рахимов К.Д., Адекенов С.М. Ранозаживляющие свойства эфирного масла Artemisiaglabella/ Кагг.сі Кір. // Растит. Ресурсы. - 2004. - Т. 40, вып. 2. - С. 101- 107.
8. Кириченко Е.Б., Орлова Ю.В., Курилов Д.В. Artemisialercheana (Web.) как продуцент эфирных масел // Физиология растений. - 2008. - №6. - С. 934-941.
9. Алиев Н. Н., Гаджиев В.С., Сафиева Л.А., Алескерова А. Н. Баку 2009 / Патент № Р12009 0194. Профилактические средства обладающие протозооцидным действием.
10. ValeriAnnWorwod .The complete Book of Essentioloils и Aroma therapy. - Novato, CA: NewWorldLibrary, 2010. - 188 р.
11. Алиев Н. Н., Алили М.И, Сафиева Л.А., Алескерова А. Н Протозооцидное средство против возбудителей протозозов. - Баку: 2012. Патент № Р 2012 0100 27.11.2012.
12. Алескерова А.Н, Ибрагимова С.И. Серкеров С.В., Садырбеков Д.Т., Рязанцев О,Г. и др. «Компонентный состав эфирного масла Аrtemisia issayevii Rzazade», Институт Ботаники НАН Азербайджана // Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия». - Караганда: 2012. - Т. ХХХІѴ. - С.142-144.
13. Mykoyama A., Ushijima H. et al. Inhibition of rotavirus and enterovirus in tea extracts // Jap. J. Med. Sci. and Biol. - 1991. - Vol. 44, №4. - Р. 81-86.
14. Gering A.V., TizhanovKh.I., Zhabayeva A.N., Atazhanova G.A. Development of technology of the medicinal spray on the basis of essential oil of Artemisia glabella/ International scientific and practical conference. Achievement and prospects for development of phytochemistry. - Karaganda: 2015. - 183 р.
15. Asadova А.І, Aleskerova A.N., Serkerov S. V. Antiviral Activity of the Artemisia szowitziana (Bess.) Grossh. and A. issayeviiRzazade and Achievements and prospects for the development of phytochemistry. - Karaganda: 2015. - 144 р.
16. Григорьева Л.В. Энтеровирусы во внешней среде. - М.: 1968. - 287 с.
17. Лябина Л.М., Соминина А.А., Черенковская И.А. и др. Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами. - Ленинград: 1975. - 41 с.
18. Алиев Н.Н., Курбанов С.М, Асадова А.И. и др. Использование ряда лекарственных растений в лечении и профилактики острых респираторных заболеваний. - Баку: 2000. - 8 с.