Выделение полифлаванов из травы горца перечного для использования в фармацевтической промышленности

В данной статье представлены результаты работ по выделению полифлаванов из травы горца перечного (лат. Polygonum hydropiper L.), который является распространенным дикорастущим растением в том числе и произрастающим на территории Казахстана, и являющийся очень перспективным сырьем для выделения полифлаванов. Так же дано описание оптимальных методов выделения полифлаванов, выбор наилучшего осадителя и количества осадителя для наибольшего выхода. 

Введение. Богатая и разнообразная флора Республики Казахстан может быть источником доступного и дешевого сырья для производства жизненно важных фитопрепаратов широкого спектра действия. Однако, ее недостаточная изученность приводит к тому, что основное количество лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе завозится в Казахстан из стран ближнего и дальнего зарубежья.

Изучение биологической активности полифлаванов, содержащихся в растительном сырье, а также полученных на их основе производных, выявило их высокую противоопухолевую, противовоспалительную, ранозаживляющую, гепатопротекторную, противовирусную и антибактериальную активность, малую токсичность, а также отсутствие аллергизирующих и кумулятивных свойств [1-4]. Поэтому химическое исследование полифлаванов казахстанских растений, технологии их выделения и направленной модификации, создание фитопрепаратов на их основе является актуальным как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Достаточные для промышленного извлечения количества полифлаванов содержат казахстанские растения семейств: Salicaсеае, Fagaсеае, Polygonaceae, Geraniaceae, Anacardiaceae и др., однако, наиболее перспективными источниками полифлаванов являются растения рода горец (Polygonum L.) [5-7].

В связи с этим, целью исследования был поиск эффективных методов селективного извлечения полифлаванов из травы горца перечного (Polygonum hydropiper L.).

Материалы и методы. Для выделения суммы полифлаванов использовали последовательную экстракцию высушенной и измельченной травы горца перечного, бензолом (для удаления хлорофилла, неполярных веществ, смол), эфиром, этилацетатом и этиловым спиртом. Экстракты концентрировали в мягких условиях (температура не выше 40⁰С, вакуум водоструйного насоса).

Концентрат этилацетатного экстракта был рехроматографирован на колонке с сефадексом LH-20, элюируя компоненты экстракта водно-спиртовыми смесями состава от 1:9 до 1:1.

Спиртовый концентрат повторно рехроматографировали на колонке с сефадексом HW-40, используя в качестве элюента водный метанол (10^20^30^40^50% MeOH) и метанол- вода-ацетон (7:1:2).

Контроль за разделением растительных веществ осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254 в системах: бензол - этиловый спирт (1:1) и бензол-ацетон (1:3) [8], элюаты объединяли и концентрировали. Полифлаваны выделяли обработкой полученных фракций 10% раствором свинца ацетата с последующим отделением осадка их солей центрифугированием и гидролизом солей 5% кислотой серной. Сернокислый маточник нейтрализовали насыщенным раствором натрия бикарбоната, концентрировали.

Дополнительную очистку и анализ полифлаванов осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии в системах: LiChrospher-100 RP18 (5 мкм), подвижная фаза - 0.01М фосфорная кислота - 0.01М дигидрофосфат калия - ацетонитрил (47.5:47.5:5), с использованием УФ-детектора (254 нм) и при повышении концентрации ацетонитрила в 0.1М орто-форфорной кислоте от 0 до 15% за 180 минут, с дальнейшим элюированием смесью ацетонитрила и муравьиной кислоты при повышении концентрации ацетонитрила от 0 до 30% 80 мин при расходе подвижной фазы 1 мл/мин и использовании УФ-детектора (280 нм) [8]. Количественное определение полифлаванов в полученных экстрактах проводили по методике [9].

Результаты и обсуждение. Фитохимический анализ растительного сырья показал наличие в его составе 8.82% полифлаванов, в пересчете на абсолютно сухое сырье. При выделении целевой группы БАВ из 100 г. травы горца перечного, произведенного по приведенной методике, удалось выделить 4.59 г очищенной суммы полифлаванов, при влажности растения 6.34%, что составляет лишь 52.95% от их общего содержания в объекте исследования. Т.е. анализ методики извлечения полифлаванов показал ее недостаточную эффективность.

Для повышении селективности выделения полифлаванов были изучены: влияние природы реэктрагента (в базовом методе) на их максимальное извлечение, влияние соотношения растительное сырье - реэкстрагент; влияние типа и концентрации осадителя для седиментации.

Подбор оптимального экстрагента осуществляли при соотношении сырье-экстрагент 1:3 по объему, в условиях термической экстракции при температуре кипения растворителя в течение 2 часов (таблица 1).

Таблица 1 - Результаты исследования экстрактов на содержание полифлаванов, в % от количественного содержания в растении

Данные таблицы 1 показывают, что по эффективности извлечения целевой группы БАВ, для селективного выделения полифлаванов, экстрагенты можно расположить в следующий ряд: 50% ацетон > этилацетат > ацетон > 50% спирт этиловый > этанол > подщелоченная вода (рН 8) > вода очищенная > подкисленная вода (рН 6) > диэтиловый эфир > диоксан. Таким образом, даже однофакторная модификация методики с заменой реэкстрагента, дает повышение выхода полифлаванов на 9.56%.

Для выбранного оптимального реэкстрагента определяли его оптимальное объемное соотношение. Исследование проводилось при соотношениях сырье-реэкстрагент от 1:3 до 1:10 по объему, в условиях термической экстракции при температуре кипения растворителя в течение 2 часов (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты анализа экстрактов для извлечения полифлаванов при различном соотношении сырье-реэкстранент, в % от содержания в растении

Анализ представленных в таблице данных показывает, что оптимальным соотношением сырье:реэкстрагент для максимального извлечения полифлаванов, при использовании 50% ацетона, является - 1:5, увеличение выхода целевой группы БАВ при большем содержании реэкстрагента незначительно, и, как следствие, экономически не эффективно.

Для повышения селективности осаждения полифлаванов из общих экстрактов, исследовали возможности их дробной седиментации - антипирином, нитрозометилуретаном, солями одно- и двухвалентной меди (таблица 3).

Таблица 3 - Выход суммы полифлаванов при дробной седиментации, в % от содержания в растении

83.59 CuSO4 20%

Данные таблицы 3 доказывают, что по эффективности седиментации полифлаванов можно вывести следующий ряд: нитрозометилуретан > соли двухвалентной меди > антипирин > соли одновалентной меди, причем, если для всех изученных осадителей, в целом выполняется общая закономерность, что при увеличении концентрации осадителя, степень извлечения целевой группы также возрастает, то оптимальные концентрации осадителей в каждом случае были различны - для нитрозометилуретана - 7%, для медного купороса - 20%, для антипирина - 10% и для хлорида закисной меди - 15%. Оптимальным седиментационным агентом для селективного осаждения полифлаванов в растительных экстрактах следует признать - CuCl 15%.

Выводы. Была проведена оптимизация метода селективного извлечения растительных полифлаванов для последующего использования в фармпромышленности. Установлено, что при использовании 50% водного ацетона в качестве реэкстрагента, в объемном соотношении 1:5 и использовании 15% раствора хлорида закисной меди, как седиментационного агента, извлечение комплекса растительных полифлаванов удается повысить в 1.64 раза.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. R.W.Hemingway, J.J.Karchesy. Chemistry and significance of condensed tannins. - New York: Plenum Press, 1989.- 538 p.- ISBN 978-14684-7511-1.
2. S.K.Talapatra. Chemistry of plant natural products: stereochemistry, conformation, synthesis, biology and medicine. - London: Springer,
3. - 1180 p.- ISBN 978-3-642-45410-3.
4. G.Brahmachari. Chemistry and pharmacology of naturally occurring bioactive compounds. - New York: CRC Press, 2013.- 582 p.
5. В.А.Куркин. Фармакогнозия.- Самара: Офорт, 2007.- 1238 с.
6. М.К.Кукенов. Лекарственные растения Казахстана и их использование.- Алматы: Ғылым, 1996. - 344 с.
7. G.G.Nikоlаevа, M.V.Lаvrentevа, І^.^ко^ѵа. Phenolic compounds from several Polygonum species // Chеm. №tur. Comp. - 2009. - №5.- P. 735-738.
8. А.В.Лазарев, С.В.Недопекина. Обзор рода Polygonum L. Научные ведомости. - М.: 2009. - Т. 11. - С. 18-24.
9. Р.А.Музычкина, Д.Ю.Корулькин. Методология исследования растительных метаболитов. - Алматы: MV-Print, 2012. - 324 с.
10. Государственная Фармакопея Республики Казахстан. - Алматы: Жибeк Жoлы, 2008. - Т.1. - С. 233-234.