Влияние генетических факторов на противовирусную активность иммунной системы при хронической hcv-инфекции

Статья посвящена исслеДованию соответствия генотипа гена ИЛ-28В показателям противовирусной активности больных хроническим вирусным гепатитом С в хоДе получения противовирусной терапии пегилированным интерфероном а и рибавирином. Было установлено, интерфероновый статус при «благоприятных» генотипах (СС или ТТ) гена IL-28B характеризовался более высоким уровнем ИФН-альфа и ИФН-гамма при сравнительно более низком уровне анти-ИФН-альфа в отличии от состояния этого статуса при «неблагоприятных» генотипах (неСС и не ТТ), что вероятно и обуславливает эффективность или неэффективность провоДимой противовирусной терапии.

Введение. HCV-инфекция входит в число социально значимых заболеваний. По оценке ВОЗ, в мире 170 млн людей, или 3% населения, инфицированы вирусом гепатита

С. Ежегодно регистрируются 3-4 млн новых случаев заражения. Хроническая HCV-инфекция (ХВГС) снижает трудоспособность, повышает риск развития серьезной депрессии, увеличивает затраты медицинских ресурсов, увеличивает смертность.

Генетические факторы организма человека взаимосвязаны с эффективностью лечения ХВГС, так как имеются этнические различия в ответе на лечение. Показано, что два из этих SNP имеют более высокую прогностическую ценность благоприятного ответа на лечение у ВГС-инфицированных пациентов с 1 генотипом rsl 2979860 [5, 12] и rs8099917 [4, 6,8]. Однако еще окончательно не определено, какой SNP в наибольшей степени влияет на СВО. Однако некоторые исследования доказывают большую прогностическую ценность определения SNP rsl 2979860 по сравнению с rs8099917 [3]. Выявлено, что частота «благоприятного» аллеля С в участке rsl 2979860 гена IL28B была самой высокой у азиатов и самой низкой у афроамериканцев. Более того, частота распространенности СС генотипа rsl 2979860 взаимосвязана со СВО в каждой популяции [5].

При высоком медико-социальном значении хронической HCV-инфекции изучение иммунопатогенеза заболевания, а также механизмов резистентности больных к терапии основными противовирусными препаратами (пегилированным интерфероном а и рибавирином) позволяет не только повысить эффективность лечения, но и выявить факторы, ответственные за спонтанное освобождение организма от возбудителя и развитие хронического инфекционного процесса.

Целью нашего исследования было определение частоты встречаемости полиморфизмов гена интерлейкина-28В (IL- 28B) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и изучение взаимосвязи значимых полиморфизмов гена IL- 28B с показателями противовирусной активности организма.

Материалы и методы: Нами обследовано 128 больных ХВГС, в возрасте от 16 до 58 лет (средний возраст 35,6±2,8). Длительность заболевания колебалась от 1 года до 10 лет (в среднем 3,8±1,1 года). Диагноз установлен врачами инфекционистами и гепатологами на основании результатов клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов исследования. Диагноз был верифицирован на основании клиниколабораторных данных на основании приказа МЗ РУз № 5 от 05.01.2012 г. Комплекс первичного обследования включал традиционный набор клинических и лабораторных показателей, УЗИ, серологических маркеров (анти-HCV-IgG). Определение интерферонового статуса антитела к ИФН-а) проводили с автоматического фотометра для микропланшета при длине волны 450 нм методом иммуноферментного анализа на анализаторе «Stat-Fax» (США). Наборы реагентов производства «Вектор-Бест», Новосибирск (РФ).

У больных использован метод ПЦР для определения RNA- HCV в крови. Генотипы HCV (1а, 1в, 2а, 2в, 3а) и нуклеотидный полиморфизм гена IL-28B определяли с помощью ПЦР-метода с использованием специфических праймеров. Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов были использованы препараты ДНК, полученные из 5 мл венозной крови. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной модифицированным Генотипирование пиросеквенирования (PyroMark Q24, PyroMark Gold Q24 Reagents, Qiagen, Germany). Репликационное генотипирование проводилось методом HRM-qPCR (Stratagene M*3005P, Agilent Technologies, Germany; DT-Prime, ДНК-Технология, Россия).

Результаты и обсуждение.

Нами было изучены нуклеотидные полиморфизмы гена IL- 28B по rsl2979860 и rs8099917 в различных группах: контрольная группа, общая группа больных ХВГС, больные ответившие на противовирусную терапию (ПВТ), больные, неответившие на ПВТ и группа лиц, самоизлечившихся от гепатита С. Распределение встречаемости вариантов нуклеотидного полиморфизма гена IL-28B в зависимости от рассматриваемых локусов в этих группах представлено на рис. 1 и 2.

По представленным данным (рис.1) видно, что по локусу rsl2979860 наиболее часто встречаемым генотипом был СТ, затем генотип СС, и наименьшее распространение имел генотип ТТ. Однако распространенность среди рассматриваемых групп была несколько иной: в группе лиц, самоизлечившихся от гепатита С частота генотипа СС была 80,1% случаев, в то время как в группе, ответивших на терапию в 41,6% случаев (в контрольной группе - 36,0%), а среди больных, неответивших на ПВТ данный генотип выявлен не был. Таким образом, отмечается более «благоприятная» настроенность генотипа СС относительно исходов заболевания и эффективности терапии по сравнению с другими генотипами по локусу rsl2979860.

87,5

• Контроль
• Больные ХВГС
• Ответчики
• Неответчики
• Выздор-е

Рисунок 1 - Распределение генотипов гена ИЛ-28В по локусу rsl2979860

100

• Контроль
• Больные ХВГС
• Ответчики
• Неответчики
• Выздор-е

Рисунок 2 - Распределение генотипов гена ИЛ-28В по локусу rs8099917

При рассмотрении распределения генотипов по локусу rs8099917, наиболее часто встречался генотип ТТ, генотип GG был выявлен только в 5% случаев в контрольной группе, у больных ХВГС данный генотип нами выявлен не был. Генотип ТТ отмечен у 100% лиц, самоизлечившихся от гепатита С, однако этот генотип был выявлен в 76,9% случаев в группе, ответивших на терапию и в 37,3% случаев в группе, не ответивших на ПВТ (в контрольной группе - 57,0%).

Учитывая, что активность патологического процесса отражает степень реагирования со стороны организма на внедрение инфекта, мы изучили противовирусную активность организма на основании показателей интерферонового статуса в сравниваемых группах больных. Далее мы изучали состояние интерферонового статуса организма, имеющего важное значение в реализации противовирусного иммунитета. Нами исследованы сывороточные концентрации ИФН-альфа, Ат к ИФН-альфа и ИФН гамма. Анализ полученных результатов основных интерферонов в сыворотке крови больных ХВГС в зависимости от генотипов гена ИЛ-28В СС и не-СС, а также ТТ и не-ТТ показал, что сывороточное содержание ИФН- альфа у больных ХВГС во всех группах был достоверно понижен. Анализ показал, что при сравнении значений ИФН-альфа между группами, нами было выявлено, что в группе больных СС генотипом уровень ИФН-альфа составил 12,5±1,4пг/мл, в группе больных не-СС генотипами - 9,2±1,8пг/мл, а в контрольной группе - 16,85±3,8пг/мл. В обеих группах больных ХВГС уровень ИФН-альфа был снижен достоверно по сравнению с данными контрольной группы, причем, в группе больных не-СС сывороточная концентрация ИФН-альфа была наименьшей и достоверно отличалась от значений больных генотипом СС в 1,4 раза. При не-ТТ выявлено достоверное снижение ИФН-альфа по сравнению со значением ТТ в 1,43 раза. В группах больных не-СС и не-ТТ сывороточная концентрации ИФН-альфа были наименьшими.

По уровню антител к ИФН достоверные различия выявлены между группами больных генотипами СС т не-СС, ТТ и не-ТТ, наибольшие значения антител к ИФН-альфа вывлены в группах больных не-СС и не-ТТ в 1,2 и 1,4 раза соответственно.

Что касается больных ХВГС ТТ и не-ТТ генотипами, то уровни ИФН-альфа также были снижены достоверно в сравнении со значением контрольной группы, и при этом достоверно отличались между собой. Так, сывороточная концентрация ИФН-альфа в среднем в группе больных ХВГС ТТ генотипом гена ИЛ-28В составила 13,9±1,4пг/мл, тогда как в группе больных ХВГС не-ТТ генотипами - 9,82±0,7пг/мл, различия в 1,43 раза. Как видно, тенденция к снижению сывороточных концентраций ИФН-альфа в исследуемых группах достаточно ясно наблюдалась, причем, как в группе больных ХВГС СС и не-СС, так и в группах больных ТТ и не-ТТ. Как было сказано выше, в группах больных не-СС и не-ТТ сывороточная концентрации ИФН- альфа были наименьшими. К сожалению, мы не нашли таких данных в литературе, но имеются данные о том, что в группах больных гомозиготными аллелями наблюдается более благоприятная картина в изучении гематологических и иммунологических параметра.

Далее мы рассмотрели уровни антител к ИФН-альфа. Анализ показал, что в группе больных генотипами СС и не-СС было выявлено, что наибольшее значение антител к ИФН-альфа наблюдалось в в группе больных не-СС генотипами гена ИЛ- 28В, тогда как анализ антител к ИФН-альфа при изучении в группах больных ТТ и не-ТТ показал наибольшее значение наблюдалось в группе больных не-ТТ. Так, в группах больных СС и не-СС значения были таковы: 3,8±0,2пг/мл и 4,4±0,9пг/мл соответственно, при норме 3,4±0,7пг/мл. в группах больных ТТ и не-ТТ: 2,8±0,8пг/мл и 3,9±1,3пг\мл, соответственно при контрольном значении 3,4±0,7пг/мл. Достоверные различия были выявлены между группами больных генотипами ТТ и не-ТТ, следовательно, анализ показал, что наибольшие значения антител к ИФН-альфа были вывлены в группе больных не-СС и не-ТТ.

Анализ ИФН-гамма в группах больных ХВГС в зависимости от различных генотипов гена ИЛ-28В позволил выявить, что в группах больных СС и ТТ уровень сывороточного ИФН- гамма был повышен по сравнению со значением контрольной группы и со значениями групп больных не-СС и не-ТТ. Нами выявлено, что в группе больных генотипами СС и не-СС значения ИФН-гамма были следующими: 14,2±0,9пг/мл и 8,82±1,4пг/мл, соответственно. А в группах больных ТТ и не-ТТ: 10,6±1,1пг/мл и 9,2±1,2пг/мл, соответственно при норме 8,4±0,6пг/мл.

Следовательно, анализ ИФН-гамма в группах больных ХВГС в зависимости от различных генотипов гена ИЛ-28В выявил, что в группах больных СС и ТТ уровень сывороточного ИФН- гамма был повышен по сравнению со значением контрольной группы и со значениями групп больных не-СС и не-ТТ. Выявлено, что в группе больных генотипами СС и не-СС разница в 1,6 раз, а в группах больных ТТ и не-ТТ в 1,3 раза.

Выводы: Таким образом, при генотипе СС гена ИЛ-28В по локусу rsl2979860, при котором чаще выявлялся не1 генотип вируса гепатита С, наиболее часто отмечается самоизлечиваемость и высокая эффективность ПВТ. Со стороны противовирусной активности организма это сопровождалось тем, что интерфероновый статус при «благоприятных» генотипах (СС или ТТ) гена IL-28B характеризовался более высоким уровнем ИФН-альфа и ИФН-гамма при сравнительно более низком уровне анти- ИФН-альфа в отличии от состояния этого статуса при «неблагоприятных» генотипах (неСС и не ТТ), что вероятно и обуславливает эффективность или неэффективность проводимой противовирусной терапии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ивашкин В.Т., Мамаев С.Н., Лукина Е.А. Особенности иммунного статуса у больных хроническим вирусным гепатитом С // Рос.журнал гастроэн., гепатол., колопроктол. - 2001. - №3. - С. 24-29.
2. Мицура В.М., Воропаев Е.В., Осипкина О.В., Жаворонок С.В. Полиморфизм генов интерлейкина-28В и клиническое значение его выявления у пациентов с хроническим вирусным гепатитов С // Лабораторная диагностика. - 2012.-№2.- С.86-97.
3. Davis G.L. Early virologic response to treatment with peginterferon alfa-2b plus ribavirin in patients with chronic hepatitis С // Hepatology. - 2003. - № 38. - P. 645-652.
4. Fellay D. Ge, J. et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis С treatment-induced viral clearance // J. Nature. - 2009. - Vol. 461. - P. 399-401.
5. Fried M.W. et al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis С virus infection // N Engl J Med. - 2002. - Vol. 347. - P. 975982.
6. Ge D., Fellay J., Thompson AJ. et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance // Nature. - 2009. - №461(7262). - Р. 399-401.
7. Grebely J. et al. Potential role for lnterleukin-28B genotype in treatment decision-making in recent hepatitis С virus infection // Hepatology - 2010. - Vol. 52. - P. 1216-1224.
8. Lotrich F.E. et al. IL28B polymorphism is associated with both side effects and clearance of hepatitis С during interferon- alpha therapy // Journal of Interferon & Cytokine Research. - 2011. - Vol. 31., №3.- P. 331-336.
9. Marc G.G. Diagnosis, management and treatment of hepatitis C // Hepatology. - 2009. - Vol. 49. - P. 1335-1374.
10. Pestka JM, Zeisel MB, Blaser E, Schurmann P, Bartosch B, Cosset FL, et al. Rapid induction of virus-neutralizing antibodies and viral clearance in a single-source outbreak of hepatitis C // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - №104. - Р. 6025-6030.
11. Rauch A. Genetic Variation in IL28B Is Associated With Chronic Hepatitis С and Treatment Failure: A Genome-Wide Association Study // Gastroenterology. - 2010. - Vol. 138. - P. 1338-1345.
12. Tanaka Y. et al. Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis С // Nat Genet. - 2009. - Vol. 41. - P. 1105-1109.
13. Thompson AJ. et al. Interleukin-28B polymorphism improves viral kinetics and is the strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in genotype 1 hepatitis С virus // Gastroenterology. - 2010. - Vol. 139. - P. 120-129.