Оценка r5-тропных вич -1 и уровня резистентности вич-1 к ингибиторам слияния у лжв

Наряду с антиретровирусными препаратами, угнетающими основные ферменты ВИЧ, для лечения людей, живущих с ВИЧ (ЛЖВ), разрабатываются средства с новыми механизмами действия, среди которых весьма эффективны блокаторы CCR5 рецептора, посредством которого вирус(R5-тропный вирус) проникает в клетки человека. Их называют ингибиторами слияния. Вместе с тем, за счет высокой скорости мутаций вирус приобретает тропность к другим рецепторам для внедрения в организм.Ингибиторыслияния в настоящее время еще не используются в РК, однако перед внедрением их в клиническую практику необходимо иметь данные о распространенности штаммов ВИЧ-1 различной тропности. Нами показано, что не-R5-тропные варианты ВИЧ-1 встречаются среди ЛЖВ в 4% - 8%.Первичная резистентность, обусловленная наличием не-R5-тропных штаммов ВИЧ,регистрируется на низком уровне (2,8%) среди наиболее распространенных в РК штаммов ВИЧ, что дает возможность широкого применения ингибиторов слияния в РК.

Введение. Как известно, ВИЧ для внедрения в клетку хозяина, помимо CD 4 рецептора, использует хемокиновыекорецепторыCCR5 или CXCR4. Соответственно, различают R5-тропный вирус, Х4-тропный вирус, а также ВИЧ со смешанной тропностью -R5Х4-тропный вирус. Последнее возможно при наличии в организме человека смеси из R5- и Х4-тропных вирусов или действительно мультитропных вирусов R5Х4 [1-3]. Во время острой фазы ВИЧ-инфекции у≈80-90% недавно инфицированных пациентов выявляется R5-тропный вирус, в связи с чем

считается, что другим лицам преимущественно передаются R5-тропные штаммы ВИЧ [3-4]. Вирусы со смешанной тропностью или вариантом Х4 могут преобладать у пациентов с количеством СД4 клеток менее 50/мкл [5- 6],получающих антиретровирусную терапию (АРТ), а также у ЛЖВ на поздних стадиях ВИЧ-инфекции [7-10].

Определение тропизма ВИЧ является необходимым тестом при проведении антиретровирусной терапии с использованием препаратов из класса ингибиторов слияния/проникновения. Одним из таких препаратов

Таблица 1 – Характеристика пациентов, имеющихне-R5-тропный ВИЧ.

является Маравирок - антагонист CCR5 - широко используемый в мире для лечения ВИЧ-позитивных пациентов. Данный препарат блокирует CCR5–рецептор и будет эффективен при наличии в организме человека преимущественно R5-тропного вируса [11]. Ингибиторы слияния/проникновения в настоящее время еще не используются в РК, однако перед внедрением их в клиническую практику необходимо иметь данные о распространенности штаммов ВИЧ-1 различной тропностидля возможного их применения в качестве компонента АРТ и/или постконтактной профилактики ВИЧ- инфекции в стране.

Целью данного исследования явилась оценка распространенности R5-, Х4-, R5Х4-тропных штаммов ВИЧ-1 и уровня резистентности ВИЧ-1 к антиретровирусным препаратам из группы ингибиторов слияния у ЛЖВ.

Материалы и методы. Было исследовано 150 образцов крови от ВИЧ-инфицированных пациентов г.Алматы. Выделение ДНК и амплификация фрагментаV3-петли гена envВИЧ проводили с помощью набора «AmpliSens-HIV- resist-Seq» (Россия). Секвенирование осуществляли на генетическом анализаторе AB 3130. Для получения консенсусной последовательности анализируемого участка гена env ВИЧ использовали программное обеспечение "Деона" (Россия). Определение тропизма проводили методом SVM при помощи ресурсаhttp://coreceptor.geno2pheno.org. Анализ проводился при пороговом уровне ложноположительных результатов FPR (falsepositiverate), равном 10%. Для определения лекарственной устойчивости к антагонистам ССR5 использовались Eвропейские и Германские рекомендации по тестированию на тропизм ВИЧ [12, 13]. Субтип ВИЧ-1 определяли с использованием ресурса http://comet.retrovirology.lu. Достоверность различий в частотах встречаемости оценивали с помощью критерия χ² [14].

Результаты и обсуждение. Среди обследованных пациентов доля мужчин составила 59,3%, женщин - 40,7%; средний возраст обследуемых был 37,8±10,5 (от 19 до 66 лет). 62,7% ЛЖВ не имели опыта приема АРТ; 38,7% пациентов получили АРТ.

Определение субтипа ВИЧ-1. По результатам исследования образцов крови ЛЖВ в г.Алматы были выявлены следующие варианты ВИЧ-1: CRF02_AG/А1 (78,7%); IDU-A (16,0%); В (4.0%) и CRF07_ВС (1.3%).

Определение тропизма ВИЧ. За тропизм вируса отвечает небольшой участок гликопротеина gp120 гена env (35 аминокислот), называемый V3-петлей. Определение тропизма ВИЧ методом генотипирования основано на секвенировании V3-петли гена env и дальнейшем биоинформационном анализе полученной нуклеотидной последовательности. При интерпретации результатов секвенирования могут применяться несколько видов математического анализа. Одним из ранних является метод 11/25, определяющий наличие или отсутствие в позициях 11 и 25 положительно заряженных аминокислот. Однако данный метод имеет низкую чувствительность, поскольку замены в других позициях V3-петли также могут оказывать влияние на тропность вируса [15]. В связи с этим наиболее приемлемыми методоми для интерпретации являются методы SVM (SupportVectorMachine, http://coreceptor.geno2pheno.org) и PSSM (PositionspecificScoringMatrices), показывающие наибольшую чувствительность (78-90%) [16], которые также нами использовались.

У большинства ЛЖВ (96,0%)определялисьR5-тропные вирусы, соответственно, применение антагонистовCCR5 для лечения этих пациентов будет эффективно. У6 пациентов (4%) обнаружены не-R5-тропные вирусы - Х4 или Х4R5. Основные характеристики пациентов, имеющих не-R5- тропный вариант ВИЧ, представлены в таблице 1.

Аминокислотные замены в позициях 11 и/или 25, характерные для Х4-тропного вируса, были выявлены только у трех ЛЖВ, что составило 2% . При этом один образец (№181) в ресурсе geno2pheno (G2P) характеризовался, как R5-тропный. Однако поскольку в этом образце определялась мутация в позиции 25, он был принят нами как образец, содержащий Х4-тропный вирус. Варианты ВИЧ, содержащие не-R5-тропные вирусы, были выявлены практически с одинаковой частотойв группах пациентов, принимающих АРТ и без опыта приема противовирусных препаратов (5,4 и 3,2%, соответственно, χ²= 0,56; Р>0,05).Среди пациентов, получающих АРТ менее 2 лет,был зарегистрирован один случай не-R5-тропного варианта ВИЧ (2,5%), в группе пациентов с длительностью АРТ более 5 лет – данный показатель составил 12,5% (χ²=

2,96; Р>0,05). Таким образом, длительность АРТстатистически значимо невлияла на частоту появления не-R5-тропныхВИЧ. В то же время, убольшинства пациентов (83,3%), имеющих не-R5-тропные штаммы ВИЧ, показатели СД4 составляли менее 200 кл/мкл.В одном случае не-R5- тропныйвариант ВИЧ выявлен у пациента, не получающего лечение, с уровнем клеток СД4 более 500/мкл (16,7%). Наблюдались статистически достоверные отличия в частоте встречаемости не-R5-тропных штаммов в изолятах ВИЧ различных субтипов. Среди образцов субтипа В количество не-R5-тропных составило 33,3 %, субтипа А – 8,3% и CRF02_AG - только 1,7 % (χ²= 38,1, Р<0,01).

Клиническая интерпретация генотипического теста по прогнозированию тропизма ВИЧ. Тропизм ВИЧ определялся при помощи генотипического теста,

Таблица 2 - Прогнозирование тропности ВИЧ по разным алгоритмам

чувствительность которого значительно ниже фенотипического теста, но доступность - выше. При анализе вирусов не-В-субтипов часто возникают сложности, обусловленные тем, что большинство алгоритмов были получены в странах с преобладанием ВИЧ-1 субтипа В, чего не наблюдается в Казахстане. В связи с этим, для клинической интерпретации теста сложно выбрать уровень допустимости ложноположительных результатов (FPR), который может быть установлен в пределах от 1% до 20%. Европейскиерекомендации[13]определяют уровень FPR в 10%, которыйобеспечивает наилучший баланс между специфичностью и чувствительностью для

прогнозирования X4 или R5X4 тропизма, чтобыло подтверждено для ВИЧ-1 подтипа В и С подтипа [17]. Такой же уровень рекомендуют использовать и разработчики генотипических тестов для всех других субтипов ВИЧ. В работе Mbrondji-Wonje и соавт.[2]показано, что повышение FPR до 15 %, приводит к увеличению чувствительности теста при прогнозировании не-R5-тропных вариантов ВИЧ- 1CRF02_AG, но в то же время,увеличивает долю ложноположительных результатов. Применяя уровень FPR в 15% при прогнозировании тропизма ВИЧ, количество не-R5- тропных вариантов ВИЧ в исследуемой нами группе ЛЖВ увеличивается до 8% (таблица 2).

Тем не менее, оптимальными для

являются

клинической практики более рекомендации

ВИЧ,

согласно

тропизма

по разработанные которым при прогнозированию специалистамиГермании[13], получении FPR менее 5 %не лечение антагонистами CCR5, т.е. предлагается расценивать данные образцы, как Х4-тропные. При уровне FPRв диапазоне 5-15%, образцы следует характеризовать, как имеющие ограниченную чувствительность к блокаторам CCR5, т.е. пациенты могут иметьне-R5-тропные варианты таких случаях перед необходимо оценивать пациента, возможность рекомендуется проводить

ВИЧ (Х4 или Х4R5). В применениемантагонистовCCR5 предыдущий опыт лечения применения доступных лекарств, уровень СД4 и другие факторы.ПриFPR свыше 15 % можно без ограничений включать антагонисты CCR5 в схемы АРТ.

Заключение. В ходе исследования было показано, что не- R5-тропные варианты ВИЧ-1 встречаются среди ЛЖВ в 4% - 8% случаев (в зависимости от выбранного алгоритма), причем чаще у пациентов с показателями СД4 менее 200 клеток/мкл и инфицированных субтипом В. Первичная резистентность, обусловленная наличием комплекса мутаций в V-петле гена env ВИЧ, регистрируется на низком уровне (2,8%) среди наиболее распространенных в РК штаммов ВИЧ (варианты 02_ AG/А1и А1), что дает возможность широкого применения препаратов класса антагонистов слияния для АРТна территории Казахстана.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Хамитова К. Биологические свойства штаммов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Москвы и Московской области: Автореф. дисс. ... канд.биол.наук – М., 2012. – 28 с.
2. Mbondji-WonjiC., RagupathyV. et.al. Genotypic Prediction of Tropism of Highy Diverse Strains from Cameroon // Plos One. – 2014. - V.9. - Р. 1124-1134.
3. Hoffmann C.The Epidemiology of HIV CoreceptorTropism // Eur J Med Res. – 2007. - №12. - P. 385-390.
4. Moore J.P., Kitchen S.G., Pugach P., Zack J.A. The CCR5 and CXCR4 coreceptors—central to understanding the transmission and pathogenesis of human immunodeficiency virus type 1 infection // AIDS Res Hum Retroviruses. – 2004. – №20(1). - P. 111-126.
5. Connor R.I., Sheridan K.E., Ceradini D., et al. Change in coreceptoruse correlates with disease progression in HIV-1-infected individuals // J Exp Med. – 1997. - №185(4). - P. 621-628.
6. Brumme Z.L., Goodrich J., Mayer H.B., et al. Molecular and clinical epidemiology of CXCR4-using HIV-1 in a large population of antiretroviral-naive individuals // J Infect Dis. – 2005. - №192. -P. 466-474.
7. Hunt P.W., Harrigan P.R., Huang W., et al. Prevalence of CXCR4 tropism among antiretroviral-treated HIV-1-infected patients with detectable viremia // J Infect Dis. – 2006. – №194(7). – P. 926-930.
8. Wilkin T.J., Su Z., Kuritzkes D.R., et al. HIV type 1 chemokine coreceptoruse among antiretroviral-experienced patients screened for a clinical trial of a CCR5 inhibitor: AIDS Clinical Trial Group A5211 // Clin Infect Dis. – 2007. - №44(4). –P. 591-595.
9. Moyle G.J., Wildfire A., Mandalia S.,et al. Epidemiology and predictive factors for chemokine receptor use in HIV-1 infection // J Infect Dis. – 2005. - №191. - P. 866-872.
10. Poveda E., Briz V., de Mendoza C., et al. Prevalence of X4 tropic HIV-1 variants in patients with differences in disease stage and exposure to antiretroviral therapy // J Med Virol. – 2007. - №79. - P.1040-1046.
11. GulickR.M., LalezariJ.Maraviroc for Previously Treated Patients with R5 HIV-1 Infection // Engl J Med. – 2008. - №359. - P. 1429-1441.
12. Vandekerckhove L.P., Wensing A.M., Kaiser R., et al.European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing // Lancet Infect Dis. – 2011. - №11. - P. 394-407.
13. EmpfehlungenzurBestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs.Anhangzu den deutsch-österrei chischen Leitlinien zurantiretroviralen Therapie der HIV-Infektion. -Version 1.0. -Vom. 13.05.2014.
14. Гланц C. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998. – 459 с.
15. БобковаM.P. Лекарственная устойчивость ВИЧ. – М.: 2014. – 284 с.
16. Лапатухин А.Э., Киреев Д.Е., Куевда Д.А.Разработка единой стандартизированной методики определения тропизма ВИЧ у пациентов перед введением в состав АРВ-терапии препарата – антагониста CCR5-рецепторов // Сб. трудов Всероссийской конференции «Молекулярная диагностика-2010» . – М.: 2010. - С. 59-63.
17. Recordon-Pinson P., et al. Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 tropism versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the GenoTropism study // XVIII International HIV drug resistance workshop: basic principles and clinical implications. – Florida: 2009. - №111. – Р. 18-29.