Oпределение антигенов гистосовместимости для трансплантаций органов и тканей. bыявление нового аллеля hla-dqb1*03:82

В статье представлено описание нового аллельного варианта генаHLA-DQB1, впервые выявленного в Республике Казахстан. В Научно-производственном центре трансфузиологии г. Астана в 2011 - 2015 гг. было обследовано 3501 потенциальных доноров Национального регистра гемопоэтических стволовых клетоки 936 пациентов с онкогематологическими заболеваниями (в возрасте от 0-66 лет). Методом аллельспецифического секвенирования у казахстанского онкогематологического пациента с диагнозом острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) выявлен новый аллельный вариант HLAII класса локуса DQB1*03:82. Новый аллель похож на уже ранее известный аллель HLA-DQB1*03:01, отличается заменой в кодоне 223 (TGC>TAC), приводящей к замене аденина на гуанин в 223 пептидсвязывающей бороздки. Показано, что аллель является наследуемым, а не возникшим в результате мутации при ОМЛ.

Введение: Определение гистосовместимости у пар «донор- реципиент» играет большую роль в приживлении трансплантата. По мере накопления хирургического опыта по трансплантациям и совершенствования качества Humanleukocyteantigen (HLA) типирования стало ясным, что выживаемость пересаженного органа, несомненно, связано со степенью HLA-несовместимости. Поэтому сейчас во всех трансплантологических центрах не делают пересадку «вслепую», обязательно определяют степень HLA- cовместимости у пар «донор-реципиент». Многократно доказано, что, чем меньше различий между HLA-антигенами донора и реципиента, тем успешней в конечном итоге результат, тем выше выживаемость трансплантатов [1].

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)с иммунологических позиций наиболее сложный вид пересадок, поскольку пересаживается иммунокомпетентная ткань, и в случае ее приживления иммунологический конфликт развивается в двух направлениях: «хозяин против трансплантата» и «трансплантат против хозяина» [2- 3].Поэтому основным условием для ТГСК является HLA- идентичность между донором и реципиентом. Наиболее эффективным донором при ТГСК является однояйцевый близнец или идентичный с больным по всем антигенам 5-ти локуса HLA-системы сиблинг, обследованный на высокоразрешающем типировании [4-5].

Сейчас проведение сложнейших операций по пересадке жизненно важных органов стало возможным в Казахстане. И ключевое значение в успешном осуществлении трансплантации имеет лабораторное исследование совместимости донора и пациента, так называемое HLA- типирование пересаживаемых органов и тканей. Эти исследования на протяжении уже без малого пяти лет в Казахстане осуществляет первая и уникальная на сегодня лаборатория иммунологического типирования тканей – HLA-лаборатория службы крови, созданная в 2010 году на базе Научно-производственного центра трансфузиологии (НПЦТ).С 2011 года отделение HLA-лаборатории НПЦТсогласно приказа Министерства здравоохранения

Республики Казахстан № 928 от 27 декабря 2011 года «О некоторых вопросах трансплантации тканей и (или) органов (части органов)» была определена базой лабораторного сопровождения процесса трансплантации в Республике Казахстан. Лабораторией проводятся как серологические, так и молекулярно-генетические виды исследования антигенов системы HLA. Все виды серологических исследований основаны на микролимфоцитотоксическом тесте.

Типирование, основанное на анализе ДНК, имеет несколько преимуществ по сравнению с серологическими методами: высокая чувствительность и специфичность, небольшие объемы проб, отсутствие необходимости использовать живые клетки и наличие антигенов на поверхности клетки. Также анализ ДНК дает возможность определить намного больше аллельных вариантов антигенов HLA-системы. В последнее десятилетие широко применяется секвенирование ДНК, то есть, определение нуклеиновой последовательности определенного участка хромосомы. В нашем случае, для изучения антигенов системы HLA, исследуется последовательность нуклеотидов, расположенных на коротком плече 6-ой хромосомы. Широкое применение метода секвенирования ДНК дала возможность открытия новых вариантов антигенов системы HLA [6].

В статье представлено описание нового аллельного вариантагенаHLA-DQB1, впервые выявленного в Республике Казахстан.

Материалы и методы: В НПЦТ г. Астана в 2011- 2015 гг. было обследовано 3501 потенциальных доноров Национального регистра ГСК и 936 пациентов с онкогематологическими заболеваниями (в возрасте от 0-66 лет).

Препараты ДНК для проведения HLA-типирования были получены из свежеи цельнои крови (антикоагулянт - ЭДТА) методом колоночной фильтрации с использованием наборов реагентов PROTRANSDNABox 500 FastDNA. Концентрация препаратов ДНК, определенная на спектрофотометре UV-visNanoDrop 2000 (Канада), составляла 25-40 нг/мкл при соотношении А260/А280 = 1,75-1,95.

HLA-типирование по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DRB1 проводили по технологии Sequencing Based Typing (SBT) с использованием набора реагентов PROTRANS HLA- A*, B*, C*, DRB1*, DQB1* (Protrans, Германия), основанные на технологии моноаллельного секвенирования. Анализ полученных сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения SequencePilot.

Капиллярный электрофорез осуществляли с использованием генетического анализатора 3500xl (Applied Biosystems, США). Полученные сиквенсы просматривали в программном обеспечении SeqPilotv3.14. с использованием библиотек HLA-аллелеи - IMGT/HLA.

Частоты HLA-аллелеи и частоты их гаплотипов были определены методом максимального правдоподобия с помощью алгоритма максимизации ожидания для данных с неизвестной гаметическои фазои [7-8], реализованным в программном обеспечении Arlequin v .3.1. Стандартные отклонения рассчитывали при начальном значении итерации, равном 100. В случае определения одного аллеля индивидуум считали гомозиготным по данному аллелю.

Результаты и обсуждение. В сентябре 2012 года у 83-го по счету онкогематологического пациента с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) по методу аллельспецифического секвенирования была обнаружена неоднозначность во II классе системы HLA, в локусе DQB1, такая же неоднозначность была найдена и у потенциальных доноров по материнской линий: у матери и дедушки.

У пациента был получен следующий результат HLA- типирования: HLA-A*03:01, *31:01, B*07:02, *35:01, C*03:03, *03:03, DRB1*01:01, *11:01, DQB1*03, 05:01. Новый аллель похож на известный аллель HLA-DQB1*03:01. Отличие находится в экзоне 2 в позиции 223. В этой позиции представлен аденин (A), в то время как до этого дня в этой позиции был описан только гуанин (G) (рисунок 1).

Для исключения данного изменения от точечной мутации было проведено семейное обследование. В итоге было замечено, что такая же картина наблюдалась в образцах крови матери (рисунок 2) и дедушки (рисунок 3) по материнской линии.

Результаты типирования потенциального донора мамы методом SBT: HLA-A*24:02:01G, *31:01:02; HLA-B*35:01:01G, *40:02:01; HLA-C*03:03:01G, *03:04:01G; HLA-DRB1*08:02:01, *11:01:01G; HLA-DQB1*03:02:01G, *03. Результаты типирования дедушки по материнской линий следующие: HLA-A*24:02:01G, *31:01:02; HLA-B*35:01:01G, *40:02:01; HLA-C*03:03:01G, *03:04:01G; HLA-DRB1*08:02:01, *11:01:01G; HLA-DQB1*03:02:01G, *03.

Выявленный новый аллельный вариант был подан на регистрацию в WHO Nomenclature Committeevia the IMGT/HLA Database) под номером заявления HWS 10018423 и получил официальное название: HLA-DQB1*03:82 (рисунок 4).

Заключение: Методом аллельспецифического секвенирования у казахстанского онкогематологического пациента с ОМЛ выявлен новый аллельный вариант HLA II класса локуса DQB1*03:82. Новый аллель похож на уже ранее известный аллель HLA-DQB1*03:01, отличается заменой в кодоне 223 (TGC>TAC), приводящей к замене аденина на гуанин в 223 пептидсвязывающей бороздке. Показано, что аллель является наследуемым, а не возникшим в результате мутации при ОМЛ.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., Кофиади И.А. Иммуногенетика и персонализированная медицина // Физиология и патология иммунной системы. - 2016. - №20(6). - С. 3-23.
  2. Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей // Медицинское информационное агентство. - 2003. - С.912-918.
  3. Савченко В.Г. Трансплантация костного мозга в онкогематологии. Клиническая онкогематология // Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2010. - №3(4). – С. 410-411.
  4. Ефимов Г.А., Вдовин А.С., Григорьев А.А., Филькин С.Ю., Быкова Н.А., Савченко В.Г. Иммунобиология острой реакции «трансплантат против хозяина» // Медицинская иммунология. – 2015. - №17(6). – С. 499-516.
  5. Кузьмич Е.В., Алянский А.Л., Иванова Н.Е. Анализ результатов аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от степени HLA-подбора пациента и неродственного донора // Онкогематология. -2014. - №3. - С. 25-31.
  6. Логинова М.А., Парамонов И.В., Павлов В.Н., Сафуанова Г.Ш. Генетические особенности популяции, проживающей на территории Республики Башкортостан // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2016. - №1. - С. 58-66.
  7. 7Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin. (version 3.0): An integrated software package for population genetics data analysis //Evolutionary Bioinformatics On-line. - 2005. - №1. - С. 47–50.
  8. Excoffier L., Slatkin M. Maximum-likelihood estimation of molecular haplotype frequencies in a diploid population // Molecular Biology and Evolution. -1995. - №12. - С. 921–927.
Год: 2017
Город: Алматы
Категория: Медицина
loading...