Тест-системы для иммуноферментного анализа в диагностике особо опасных инфекций

Особо опасные инфекции (ООИ) - это инфекции, которые могут возникать среДи населения в виДе отдельных заболеваний, эпиДемий и Даже панДемий, чаще сопровождая ЧС, характеризуются прироДной очаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением. Экспресс-инДикация это своеобразная развеДка большой армии лабораторной Диагностики и нахоДится на переДнем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых метоДов инДикации микробов, часть из которых в Дальнейшем иДет на вооружение и совершенствование лабораторной практики.

Возрастающая актуальность проблемы особо опасных инфекционных болезней (далее - ООИ) в современных условиях обусловлена неуклонной тенденцией появления новых и возвращения старых нозологических форм, экономическим ущербом, угрожающим стабильности Республики Казахстан, возрастанием риска актов биологической агрессии, возникновения ЧС вследствие стихийных бедствий и техногенных катастроф.

Чума - одна из немногих инфекций, при которых окончательный диагноз принадлежит не клиницисту, а лабораторной службе.Больной подлежит изоляции в специально приспособленное помещение, где назначают раннее этиотропное лечение.

В данной работе разбирается этап диагностики ООИ на примере чумы. При установлении окончательного диагноза, определяется характер противоэпидемических мероприятий, устанавливается возможный источник инфекции и механизмы его передачи. Именно в таких случаях необходимо и оправдано применение экспресс- методов диагностики ООИ, для адекватного проведения противоэпидемических, профилактических и лечебных мероприятий.

Лабораторные методы диагностики. К настоящему времени для диагностики ООИ разработаны такие диагностические методы, как МФА, РН, РСК, РДП, РНГА и др.

  1. метод флюоресцирующих антител (МФА) - визуальный учет специфического взаимодействия флюоресцирующих антител с гомологичным антигеном/8/;
  2. иммуноферментный анализ (ИФА) - иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело;
  3. реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов;
  4. реакция нейтрализации антител/антигена (РНАт/РНАг) - основана на нейтрализации антител/антигена специфическими антителами/антигеном, находящимся в исследуемом материале;
  5. полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Метод твердофазного ИФА и его применение для диагностики ООИ.

Историческая справка. Среди методов иммунохимического анализа особое место занимает гетерогенный твердофазный иммуноферментный /4,7/, базирующийся на применении в качестве маркера различных ферментов (пирофосфотаза, пероксидаза, 0-галактозидаза, щелочная фосфотаза и др.). ИФА используют для определения вирусных и бактериальных антигенов, серологического анализа инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также для оценки эффективности вакцинации. Преимущество ИФА перед другими методами является высокая стабильность используемых реактивов и результатов, отсутствие необходимости работ с радиоактивными веществами, а также децентрализация при массовых обследованиях.В начале 1970-х гг. E.Engvallи P.Perlmann /4,8/ и независимо от них B.K. VanWeemanи A.H.W.M.Schuurs /4,9/ предложили для выявления и количественного определения антигенов и антител без применения агглютинации частиц или радиоактивных меток более чувствительных и универсальных меток для иммуноанализа - ферменты. E.Engval^

P.Perlmannпредложили сокращенно называть этот анализ enzyme-linkedimmunosorbentassay (ELISA) /4,8/, что означает фермент-зависимый иммуносорбционный анализ. Суть состоит в том, что сначала отделяют меченые и немеченые антигены, связавшиеся с антителами, от свободных антигенов и только потом измеряют активность метки в одной из двух фракций. Такие методы относят к иммуноанализу с разделением компонентов. Поскольку фракционирование анализируемой смеси неизбежно предполагает использование гетерогенных фаз, иммуноанализ с разделением компонентов часто называют гетерогенным иммуноанализом.

В 1972 г. K.E.Rubensteinetal. разработали иммуноферментный анализ, не требующий перед измерением ферментативной активности разделения связанных с антителами и свободных антигенов. Метод основан на изменении удельной активности фермента при связывании антител с антигенами, содержащими ферментную метку. Ферментативная активность нефракционированной анализируемой смеси пропорциональна количеству меченных ферментом антигенов, не связавшихся с антителами. При таком анализе гетерогенные фазы для разделения связанных и свободных антигенов не требуются, поэтому его называют иммуноанализ без разделения компонентов /5/.С тех пор, как ферменты в 1971 г. впервые были предложены в качестве меток для иммуноанализа, ИФА широко используется в диагностике вирусных и бактериальных болезней /1, 2, 3, 4, 5/. Благодаря им решены важные научные проблемы биологии. Успех этих методов объясняется их высокой специфичностью, чувствительностью, простотой в исполнении и возможностью полной автоматизации процессов реакций /2,4/. Наибольшее применение в диагностике целого ряда вирусных заболеваний человека и животных нашли методы твердофазного ИФА /6, 7, 8, 9/. Твердофазный (гетерогенный) метод ИФА основан на использовании антител и антигенов, иммобилизованных на твердом носителе. Этот комплекс, названный иммуноадсорбирующим, позволяет уловить антиген или антитела в исследуемом растворе. Полученный таким образом иммунный комплекс выявляют путем введения вторичного антитела или антигена, но уже меченого ферментом. Впервые твердофазный ИФА был описан в 1972 г /5/, и в настоящее время он широко известен под названием метод "ELISA"- энзимсвязанный иммуноадсорбирующий анализ. В зависимости от того, исследуют антиген или антитело и применяют различные модификации этого метода.

Применение метода ИФА в практике подтвердило его широкие возможности для обнаружения бактериальных и вирусных антигенов и антител к ним, токсинов, гормонов и других биологически активных веществ. Показана возможность создания отечественных ингредиентов для иммуноферментного анализа.В Республике Казахстан разработкой иммуноферментного анализа начали заниматься с начала 80-х годов, в настоящее время этот метод хорошо освоен, разработан и используется во многих крупных научно-исследовательских центрах, лабораториях и диагностических учреждениях. Для обнаружения антигена применяют следующие варианты ИФА: прямой метод адсорбции антигена; прямой "Сэндвич"-метод; непрямой "Сэндвич"- метод (с использованием антивидовых антител); конкурентный метод с иммобилизованным антигеном; конкурентный метод с иммобилизованным антителом. Для выявления антител применяют такие методы, как прямой "Сэндвич» - метод (по принципу ингибирования), непрямой "Сэндвич-метод" и метод конкуренции антител. Все разнообразие методов твердофазного ИФА можно объединить в две группы - конкурентные и неконкурентные.

Конкурентные методы ИФА. Эти методы основаны на принципе конкуренции известного количества меченого антигена или антитела с неизвестным количеством того же самого антигена или антитела, но уже не меченного ферментом, за третий компонент реакционной смеси, адсорбированы на твердом носителе. В этих методах о наличии в пробе аналита судят по степени подавления специфического окрашивания.

Неконкурентные методы твердофазного ИФА. В отличие от конкурентных методов, концентрация антигенов или антител, определяемая данными методами, прямо пропорционально интенсивности окрашивания реакций.

Иммуноферментные конъюгаты. Важным звеном при отработке иммуноферментных методов является приготовление и контроль иммуноферментных конъюгатов. Само же качество конъюгатов определяется свойствами фермента и антитела или антигена, входящими в его состав, а также способом изготовления конъюгата.

Заключение по обзору литературы.

Основные пути развития экспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы:

  • создание и конструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать очень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной степени исчерпали свои потенциальные возможности;
  • разработка новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа.
  • разработка комплексных методов и видов исследований. Будет продолжаться дальнейшая интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
  • создание новых схем исследований;
  • разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс- индикационных и лабораторных исследований. разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований; автоматизация и компьютеризация исследований.

При сравнении этого теста с РН, оказалось, что титры антител, выявляемые обеими реакциями, почти одинаковы. Но чувствительность ИФА составила 85 %, а специфичность - 70% по сравнению с РН /6/. Авторы объясняют это высоким уровнем фона при учете реакций, которая обуславливается присутствием следов бычьего гаммаглобулина как в культуральных антигенах, так и в кроличьей (антибычьей) сыворотке, РСК это подтвердило. Авторы все же рекомендуют использование ИФА для замены РН, так как метод оказался более дешевым и простым в исполнении, результат можно получить через 4 часа после внесения испытуемых проб сывороток в лунки плашек, тогда как при использовании РН требуется минимум 4-8 сут.

Таким образом, ИФА является весьма перспективным методом, для диагностики особо опасных инфекций, обследования диких грызунов из природных очагов, их эктопаразитов, оценки иммунологического статуса животных и человека, изучение эффективности массового применения вакцин и других биопрепаратов.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Dabrowska I., Dworecka-Kaszak B., Brillowska-Dabrowska A. The use of a one-step PCR method for the identification of Microsporum canis and Trichophyton mentagrophytes infection of pets // Acta Biochimica Polonica. -Vol. 61, Issue: 2. - 2014. - P. 375-378.
  2. Patent Number: JP2004258024-A; JP4117563-B2. Detecting dermatophytes,involves using antibody having reactivity with dermatophytes such as Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis and Epidermophyton floccosum / Kajitani K; Hoki S; Ishida H.; Patent Assignee: TOYOBO KK.
  3. Маркина М.В., Романов В.В. Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний. Новые возможности. Практическое руководство по интерпретации полученных результатов. http://www.labdiagnostic. ru/docs/specialists/immunoblot_infect.shtml
  4. Современные методы лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний. Справочное пособие для врачей. - Ростов-на-Дону: 2012. - С. 25-28.
  5. Tomtishen J.P 3rd. Human cytomegalovirus tegument proteins (pp65, pp71, pp150, pp28). Virol J 2012; 9: 22. doi: 10.1186/1743-422X-9-22.
  6. Кочиш Л.Т. Высокотехнологичная компания “Алкор Био”: современный подход к разработке и производству иммуноферментных тест-систем для аллергодиагностики // Справочник заведующего КДЛ. - 2011. - №4. - С. 3336.
  7. Соболев А.В., Аак О.В. Современная аллергодиагностика: опыт работы //Hi+Med. Высокие технологии в медицине. - 2011. - Вып. №2. - С. 8-10.
  8. Курчева С.А., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Жданова Е.В., Старцева О.Л., Жарникова И.В., Гаркуша Ю.Ю., Семирчева А.А. Разработка диагностической тест-системы для выявления специфических антител к возбудителю бруцеллеза в непрямом методе иммуноферментного анализа // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 2. - С.15.
  9. Киселева Р.Ю. Сравнительный анализ выявления амфетаминов методом ИФА и газовой хроматографии с масс- спектрометрической детекцией / Киселева Р.Ю., Мягкова М.А., Анохин Л.А., Петроченко С.Н., Смирнов А.В., Морозова В.С., Брюн Е.А. // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - № 2. - С.42-44.
  10. Киселева Р.Ю. Современные методы оценки иммунного статуса для диагностики заболеваний зависимости на основе иммунноанализа /Киселева Р.Ю., Петроченко С.Н., Постоюк Н.А., Брюн Е.А., Мягкова М.А. // Материалы Конгресса «Человек и проблемы зависимости». - Архангельск: 28-29 апреля 2010.
Год: 2017
Город: Алматы
Категория: Медицина
loading...