Криоконсервация как способ повышения лабораторной всхожести и энергии прорастания семян

В Казахстане и во всем мире существует проблема утраты биоразнообразия растительных ресурсов. Поэтому ведутся работы по созданию криогенных банков, в которых проводится длительное хранение гермоплазмы растений при сверхнизкой температуре –196 °С. Для семян, сохраняемых в криогенных банках, требуется изучение их состояния покоя и действия веществ, которые могли бы стимулировать их всхожесть. Важными объектами для исследования являются лекарственные растения, так как в Республике отсутствует отлаженная система промышленного выращивания лекарственных растений и производства фармацевтических препаратов на основе местного сырья. Поэтому требуется научная информация о долгосрочном сохранении жизнеспособного семенного материала и способах стимуляции проращивания семян. В результате проведенных экспериментов выявлено положительное влияние гибберелловой кислоты (ГК) и жидкого азота (ЖА) на увеличение процента энергии прорастания (ЭП) и лабораторной всхожести (ЛВ) семян лекарственных растений. В среднем, после воздействия ЖА на семена, увеличивался процент ЭП в 1,4 и ЛВ в 1,5 раза. После воздействия на семена ГК процент ЭП увеличивался в 1,2 раза, а ЛВ — в 2,9 раза. Выявлено, что для стимуляции ЭП и ЛВ достаточно обработки семян одним из способов, ГК или ЖА. Установлено, что семена расторопши пятнистой теряют всхожесть после хранения при температуре 1±1 °С в течение 9 месяцев. Возможно, для стимуляции ЭП и ЛВ требуется обработка химическими реагентами свежесобранных семян. Отмечена эффективность воздействия ЖА на ЭП в культуре in vitro семян валерианы лекарственной и ромашки аптечной сорт «Карагандинская» в 4,5 и в 1,8 раза соответственно. Процент ЛВ валерианы лекарственной после воздействия ЖА возрос в 1,3 раза, при этом не было отмечено влияния ЖА на ЛВ семян ромашки аптечной сорт «Карагандинская».

Введение

В Казахстане произрастает порядка 500 видов лекарственных растений, однако многие из них находятся под угрозой исчезновения [1–4]. Учитывая глобальный характер проблемы, необходимо задействование научных подходов сохранения растительных ресурсов, например, таких как криоконсервация семян при температуре жидкого азота [5, 6]. Создание семенных банков — это важная задача для всего мирового сообщества. На данный момент насчитывается около 1750 генетических банков семян по всему миру, в которых сохраняется порядка 10000 образцов, в том числе лекарственных растений [7]. В Казахстане начаты работы по сохранению семян дикорастущих видов, включая лекарственные, в РГП «Институт ботаники и фитоинтродукции» КН МОН РК при температурах: +4 °С и – 18 °С. [8]. В лаборатории криосохранения гермоплазмы РГП «Институт биологии и биотехнологии растений» КН МОН РК (ИББР), кроме режима +4 °С и –18 °С, используется также технология криоконсервации при –196 °С, работа в области криоконсервации ведется с 2002 г. [9–12]. Криогенная коллекция ИББР насчитывает более 700 образцов, в том числе на хранение заложены и семена лекарственных растений [13, 14].

Важность криогенных коллекций заключается в том, что метод криоконсервации в жидком азоте позволяет остановить физиологические процессы в растительных клетках и обеспечить длительное хранение при сверхнизкой температуре [5, 6, 9–15]. Кроме того, семенам подавляющего большинства дикорастущих и культурных растений свойственно состояние органического покоя. Некоторые из них уже через несколько часов после сбора теряют свою всхожесть, а основная масса семян теряет всхожесть в процессе хранения, даже в условиях хранения при пониженных положительных температурах. У некоторых видов покой семян настолько глубок, что для прорастания им необходима длительная и сложная предпосевная подготовка, при этом появление всходов может растянуться на несколько лет [5, 6, 16, 17].

В литературных источниках имеется достаточно много работ, касающихся возможности ускоренного проращивания семян разных видов с помощью обработки гормонами и некоторыми другими веществами, стимулирующими прорастание, а также с использованием ряда физических воздействий, в том числе и действием пониженной температуры [11, 16, 18, 19]. Во многих исследованиях продемонстрировано стимулирующее действие сверхнизких температур на ЭП и ЛВ семян дикорастущих и культурных растений. Из 60 видов растений дальневосточного региона России криоконсервация не оказала отрицательного влияния на прорастание 56 видов (93,3 %), а для 13 видов (21,7 %) ультраниз- кие температуры стимулировали всхожесть семян [20]. Положительное влияние глубокого замораживания было показано для семян дикорастущих видов семейства Poaceae, яблони Сиверса и риса [10, 11, 21].

Целью настоящей работы являлось исследование действия различных стимуляторов на лабораторную всхожесть (ЛВ) и энергию прорастания (ЭП) семян лекарственных растений: валерианы лекарственной (Valeriana officinalis L.), льна многолетнего (Linum perenne L.), расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.) и ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.) сортов «Карагандинская» и «Подмосковная» для последующего создания криобанка. Важность данного исследования заключается в том, что широко известны лекарственные свойства этих растений. Например, валериана лекарственная применяется в качестве седативного средства и как спазмолитик (в отношении гладкой мускулатуры органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и мочевыделительной системы). Обладает также желчегонным действием, увеличивает секрецию ЖКТ, расширяет коронарные сосуды. Семена льна многолетнего применяются при лечении сахарного диабета, язв, желудочно-кишечных и мочеполовых заболеваний, невралгии ожогов, сердечно-сосудистых заболеваний, лен нормализует артериальное давление, снижает уровень холестерина, устраняет аритмию и уменьшает риск развития инфаркта, инсульта и т.д. Препараты из расторопши пятнистой применяются для лечения болезней печени, селезёнки, при жёлчных камнях, желтухе, хроническом кашле и других заболеваниях. Настои и отвары цветочных корзинок ромашки и её эфирное масло применяют как желудочное, противовоспалительное, спазмолитическое, кровоостанавливающее, потогонное, антисептическое, болеутоляющее, седативное, противосудорожное, желчегонное средство, для лечения бронхиальной астмы, ревматизма, аллергических гастритов и колитов, экземы, ожогов рентгеновскими лучами и др. [2, 3, 22].

Во многих странах для производства лекарственных препаратов налажен промышленный сбор этих дикорастущих растений, организованы культурные посадки из семян, собранных в природных условиях и сортов, выведенных селекционерами [23]. Производителями фитопродукции в Казахстане являются компании «Зерде-Фито» и «Кызылмай», работающие в основном на привозном сырье [24, 25]. Единственным предприятием в стране, которое занимается сбором и выращиванием лекарственных растений в промышленных масштабах, является ТОО «Azia Gold» [26]. ТОО «Azia Gold» совместно с компанией Martin Bauer Gmbh & Co.KG в 2019 г. планировали открытие завода по переработке лекарственных трав, но планы были отложены в связи с пандемией COVID–19.

В связи со всем изложенным выше, выявлено, что в Казахстане не налажены системы выращивания лекарственных растений в промышленных масштабах и производства лекарственных препаратов на основе местного сырья. Для производителей, кроме вложений в технологию производства, требуется также научная информация о долгосрочном сохранении жизнеспособного семенного материала, а также данные о способах стимуляции энергии прорастания семян. Настоящая статья посвящена этому исследованию.

Материалы и методы

Сбор семян валерианы лекарственной, льна многолетнего, расторопши пятнистой и ромашки аптечной сортов «Карагандинская» и «Подмосковная» проводился в августе–сентябре 2020 г. (см. табл.; . рис. 1). Хранение образцов проводили в бумажной упаковке, при температуре 1±1 °С в программируемом холодильнике Indesit DF 5201 X RM. Срок хранения составил 9–10 месяцев.

Таблица

Места сбора семенного материала для исследований

Для экспериментов семена разделили на партии по 10 шт. и проращивали, используя следующие предварительные обработки:

1. Для семян всех видов растений проводили проращивание семян с предварительным замачиванием их в дистиллированной воде в течение 4 ч, после чего воду сливали, семена промывали. В чашку Петри (ЧП) на дно складывали в 4-е слоя марлю, на которую выкладывали в один слой семена (рис. 2). Все семена, кроме ромашки, сверху накрывали 2-мя слоями марли, для семян ромашки необходимо попадание прямых лучей солнечного света [27]. Кроме того, семена ромашки очень мелкие со средними размерами 0,8–1,2×0,25–0,4 мм, поэтому для того, чтобы семена не упали между слоями, на марлю сверху помещали фильтровальную бумагу, на которую выкладывали семена (рис. 1А) [22, 23, 28]. Выложенные на марлю семена заливали дистиллированной водой так, чтобы нижняя часть семян была в воде, а верхняя часть не была погружена в воду. ЧП закрывали пищевой пленкой, в которой проделывали отверстия для аэрации. Контроль 1 (К1).

1. Для семян валерианы лекарственной, расторопши пятнистой и ромашки аптечной после замачивания в течение 4 ч в дистиллированной воде, как было описано выше, проводили обработку семян в растворе гибберелловой кислоты (ГК), в виду того что по литературным данным органические кислоты стимулируют ЭП у этих видов растений [16]. Для этого семена после замачивания и промывания погружали на 1 ч в ГК в концентрации 100 мг/л. После обработки ГК семена выкладывали в ЧП с марлей, как было описано выше, для проращивания. Контроль 2 (К2).
2. Проращивание семян валерианы лекарственной и ромашки аптечной проводили в культуре in vitro. Для этого семена предварительно обработали раствором отбеливателя «Белизна» (гипохлорит натрия (5–15 %), щелочные компоненты ˂5 %, вода), разбавленного 1:4 в течение 5 мин. После чего в ламинарном боксе трижды промывали стерильной дистиллированной водой и помещали в пробирки по 5 шт. на питательную среду Кнопа (1 г/л Ca(NO3)2, 0,25 г/л MgSO4·7H2O, 0,25 г/л KH2PO4, 0,125 г/л KCl, 27,8 мг/л FeSO4·7H2O, 37,3 мг/л Na2ЭДТА·2H2O, 1,75 г/л джелрата, 4 г/л агара, pH 5,7) [29]. Контроль 3 (К3).
3. Семена всех исследуемых видов лекарственных растений без каких-либо предварительных обработок погружали на 18 ч в жидкий азот (ЖА) при температуре –196 °С. Размораживание проводили при температуре 4 °С в течение 30 мин, затем еще 30 мин при комнатной температуре. После чего семена замачивали в дистиллированной воде в течение 4 ч, промывали и ставили на проращивание в ЧП с марлей, как было описано выше. Опыт 1 (О1).
4. Семена валерианы лекарственной, расторопши пятнистой и ромашки аптечной обоих сортов погружали на 18 ч в ЖА, после процедуры оттаивания проводили замачивание в течение 4 ч и обработку в растворе ГК (100 мг/л). Проращивали в ЧП, как было описано выше. Опыт 2 (О2).
5. Семена валерианы лекарственной и ромашки аптечной сорт «Карагандинская» погружали на 18 ч в ЖА, после процедуры оттаивания проводили стерилизацию в ламинарном боксе раствором отбеливателя «Белизна» (1:4) в течение 5 мин, трижды промывали стерильной дистиллированной водой и помещали в пробирки по 5 шт. на питательную среду Кнопа. Опыт 3 (О3).

Жизнеспособность семян оценивали по ЭП проценту проросших семян на 3 сутки и по ЛВ проценту проросших семян на 7 сутки [11]. Эксперименты проводили в 3-х повторностях (n = 30). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методике, описанной в пособии Г.Ф. Лакина, и в программном пакете SYSTAT [30, 31].

Результаты и обсуждение

В результате проведенных экспериментов выявлено, что обработка семян раствором гибберелловой кислоты и жидким азотом стимулирует и энергию прорастания, и лабораторную всхожесть семян всех изучаемых растений (рис. 3).

Самый высокий процент ЭП и ЛВ после обработки ГК и ЖА был отмечен у сортов ромашки. В меньшей степени возрастает процент ЭП у льна многолетнего, ЛВ семян этого растения после обработки ЖА несколько ниже (43,3 %), чем ЛВ без обработки (53,3 %), тем не менее статистическая разница между вариантами недостоверна. Следует отметить, что достаточно обработки только ГК или только ЖА для стимуляции ЭП и ЛВ у семян всех исследуемых растений, единственно у валерианы лекарственной отмечено возрастание ЭП и ЛВ при одновременной обработке ГК и ЖА. Так ЭП при

обработке семян этого растения ГК (К2) составила 20,0 %, а при обработке и ГК и ЖА — 36,7 (О2), после погружения семян в ЖА ЭП составила 6,7 % (О1), что в 5,5 раз меньше, чем после обработки и ГК и ЖА. ЛВ семян валерианы после обработки ГК была 40,0 %, при обработке и ГК и ЖА увеличилась для 53,3 %, ЛВ после обработки ЖА — 33,3 %, тогда как после действия гормона и азота составила 53,3 %.

Как уже говорилось ранее, семена подавляющего большинства дикорастущих и культурных растений теряют всхожесть по проишествии какого-то времени даже в условиях хранения при пониженных положительных температурах. В нашем случае у семян расторопши пятнистой после хранения при температуре 1±1°С в течение 9 месяцев всхожести не наблюдалось, только после обработки ЖА было отмечено, что одно семя взошло. В данном случае требуется пересмотреть ее условия хранения, возможно, для семян этого растения для сохранения всхожести требуется погружение в ЖА сразу после сбора.

Для семян валерианы лекарственной и ромашки аптечной, сорт «Карагандинская», было проведено проращивание семян в культуре in vitro (рис. 4, 5).

Отмечено, что погружение в ЖА семян этих растений положительно сказывается на ЭП и ЛВ в культуре in vitro. Так, у валерианы лекарственной ЭП без обработки ЖА составила 6,7 %, тогда как после ЖА — 30,0 %, ЛВ этого растения до обработки была 40,0 % после ЖА — 53,3 %. У ромашки аптечной ЭП до обработки составила 20,0 %, после ЖА — 36,7 %, при этом влияния ЖА на ЛВ отмечено не было.

Заключение

Выявлено положительное влияние гибберелловой кислоты и жидкого азота на стимуляцию энергии прорастания и лабораторной всхожести семян лекарственных растений. В среднем процент ЭП после воздействия ЖА на семена увеличивался в 1,4 раза, ЛВ — в 1,5 раза. Процент ЭП после воздействия ГК на семена увеличивался в 2,9 раза, ЛВ — в 1,2 раза. При этом для стимуляции ЭП и ЛВ достаточно обработки семян или ГК или ЖА для всех исследуемых растений, так как разницы между вариантами не наблюдалось, только у валерианы лекарственной отмечено возрастание ЭП и ЛВ при одновременной обработке ГК и ЖА.

Установлено, что семена расторопши пятнистой теряют всхожесть после хранения при температуре 1±1 °С в течение 9 месяцев. Требуется провести эксперименты по определению ЭП и ЛВ семян сразу после сбора, возможно, для стимуляции ЭП и ЛВ необходима будет обработка химическими реагентами свежесобранных семян.

Отмечено, что экспозиция в ЖА в течение 18 ч положительно повлияла на ЭП в культуре in vitro семян валерианы лекарственной и ромашки аптечной, сорт «Карагандинская». Так, процент ЭП у валерианы лекарственной после обработки ЖА возрос в 4,5 раза, а ромашки аптечной — в 1,8 раза. Процент ЛВ валерианы лекарственной после воздействия ЖА возрос в 1,3 раза, влияния ЖА на ЛВ ромашки аптечной, сорт «Карагандинская» отмечено не было.

Работа выполнена в рамках грантового проекта Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан: AP09259548 «Криоконсервация семенного материала дикорастущих и лекарственных растений и организация банка краткосрочного и долгосрочного хранения».

Список литературы

1. Флора Казахстана. — Т. 7. — Алма-Ата: Наука, 1964. — 345 с.
2. Доброхотова К.В. Лекарственные растения Казахстана / К.В. Доброхотова, В.В. Чудинов. — Алма-Ата: Казах. гос. изд-во, 1961. — 109 с.
3. Грудзинская Л.М. Аннотированный список лекарственных растений Казахстана: справоч. изд. / Л.М. Грудзинская, Н.Г. Гемеджиева, Н.В. Нелина, Ж.Ж. Каржаубекова. — Алматы, 2014. — 200 с.
4. Красная книга Казахстана. — Т. 2. Растения. — Астана: ТОО «Арт Print XXI», 2014. — 452 с.
5. Dixit S. Cryopreservation: a potential tool for long-term conservation of medicinal plants / S. Dixit S., S. Ahuja A. Narula, p.s. Srivastava // Plant Biotechnology and Molecular Markers. — new-delhi: Anamaya Publisher, 2004. — P. 278–288. https:/doi.org/10.1007/1-4020-3213-7_19
6. Chen S.-L. Conservation and sustainable use of medicinal plants: problems, progress and prospects / S.-L. Chen, H.-M. Luo, Q. Wu, c.-f. Li, A. Steinmetz // Chinese Medicine. — 2016. — Vol. 11, No. 37. — P. 2–10. https://doi.org/10.1186/s13020-016-0108-7
7. [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.fao.org/3/i1500r/i1500r03.pdf8
8. [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://botsad.kz/ru/labs/view/laboratoriya_semenovodstva
9. Ромаданова Н.В. Сохранение генетического материала некоторых видов барбариса в криобанке / Н.В. Ромаданова, Л.Н. Карашолакова, И.А. Махмутова, Ф.Д. Кабулова, К.Т. Абидкулова, С.В. Кушнаренко // Вестн. Караганд. ун-та. Сер. Биология. Медицина. География. — 2019. — № 3(95). — С. 20–26.
10. Kushnarenko S. Characterization and Cryopreservation of Malus sieversii Seeds / S. Kushnarenko, E. Salnikov, M. Nurtazin, Z. Mukhitdinova, I. Rakhimbaev, b.m. Reed // The Asian and Australasian Journal of Plant Science and Biotechnology. — 2010. — Vol. 4, Spec. Iss. 1. — P. 5–9.
11. Кушнаренко С.В. Криоконсервация семян. Методические рекомендации / С.В. Кушнаренко, З.Р. Мухитдинова, М.М. Аралбаева. — Алматы: TST-Company, 2011. — 33 с.
12. Reed B.M. Evaluation of critical points in technology transfer of cryopreservation protocols to international plant conservation laboratories / B.M. Reed, I. Kovalchuk, S. Kushnarenko, A. Meier-Dinkel, K. Schoenweiss, S. Pluta, K. Straczynska, E.E. Benson // cryoletters. — 2004. — Vol. 25, No. 5. — P. 341–352.
13. Ромаданова Н.В. Каталог коллекции in vitro, криобанка и саженцев яблони, лесного и грецкого орехов / Н.В. Ромада- нова, М.А. Жексембекова, М.М. Аралбаева, Т.Е. Толеген, Т.Е. Кокен, М.М. Нурманов, С.В. Кушнаренко. — Алматы, 2020. — 58 с.
14. Romadanova N. Development of a common PVS2 vitrification method for cryopreservation of several fruit in vitro / N. Rom- adanova, S. Kushnarenko, L. Karasholakova // Cellular & Developmental Biology. — 2017. — Vol. 53, No. 4. — P. 382–393. https://doi.org/10.1007/s11627-017-9849-y
15. Medical plant conservation. — Vol. 14. — Ontario, 2011. — 36 p.
16. Николаева M.Г. Справочник по проращиванию покоящихся семян / М.Г. Николаева, М.В. Разумова, В.Н. Гладкова. — Л.: Наука, 1985. — 348 с.
17. Dowsett c.a. Adaption of a technique for the accelerated ageing of weed seeds to evaluate their longevity / С.А. Dowsett, Т. James, Р. Trivedi // New Zealand Plant Protection. — 2012. — Vol. 65. — P. 69–73. https://doi.org/10.30843/nzpp.2012.65.5427
18. Bewley j.d. Physiology and biochemistry of seeds in relation to germination / j.d. Bewley, М. Black. — Berlin; Heidelberg; New York, 1982. — Vol. 2. — 375 p. https://doi.org/10.1007/978-3-642-68643-6
19. Bareke T. Biology of seed development and germination physiology / T. Bareke // Plants & Agriculture Research. — 2018. — Vol. 8, Iss. 4. — Р. 336–346. https://doi.org/10.15406/apar.2018.08.00335
20. Воронкова Н.М. Влияние глубокого замораживания на прорастание семян растений прибрежно-морских и прилегающих территорий Дальнего Востока России / Н.М. Воронкова, А.Б. Холина // Вестн. ДВО РАН. — 2016. — № 3. — С. 31–38.
21. Турдиев Т.Т. Способ восстановления жизнеспособности и повышения всхожести семян риса после длительного хранения / Т.Т. Турдиев, Л.К. Мамонов, И.Ю. Ковальчук, Б.Н. Усенбеков, Д.Т. Казкеев, С.М. Байбасынова, А.Б. Рысбекова, А.Н. Подольских // Инновационный патент РК на изобретение № 29084 от 17.07.2013.
22. Путырский И.Н. Универсальная энциклопедия лекарственных растений / И.Н. Путырский, В.Н. Прохоров. — М.: Махаон, 2000. — 656 с.
23. Терехин А.А. Технология возделывания лекарственных растений: учеб. пос. / А.А. Терехин, В.В. Вандышев. — М., 2008. — 201 с.
24. [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://damu.kz/klienty-fonda/detail.php?ELEMENT_ID=7873
25. [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://kyzylmay.com/
26. Электронный ресурс. Режим доступа: https://www.emis.com/php/company-profile/KZ/Azia_Gold_Asia_Gold_TOO__ Azia_Gold_%D0 %90 %D0 %B7 %D0 %B8 %D1 %8F_%D0 %93 %D0 %BE%D0 %BB%D0 %B4_%D0 %A2 %D0 %9E%D0 % 9E__ru_8596189.html
27. [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://agbz.kz/kak-razvivat-biznes-na-travah/
28. Губанов И.А. Иллюстрированный определитель растений Средней России. — Т. 3. Покрытосеменные (двудольные, раздельнолепестные) / И.А. Губанов, К.В. Киселева. — М.: КМК, 2004. — 520 с.
29. Knop W. Quantitative utersuchungenüber den ernährungensprozeb der pflanze / W. Knop // Landw. Versuchssat. — 1865. — Vol. 7. — P. 93.
30. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пос. для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 с.
31. SYSTAT (2007) SYSTAT 12.0, SYSTAT Software, Inc, San Jose, CA, pp. Statistics software.