Способность экстрактов некоторых съедобных грибов подавлять репродукцию вируса гриппа

В статье описаны способы получения экстрактов из мицелия некоторых ксилофитных грибов: Pleurotus eryngii, Auricularia auricula-judae, Tremella fuciformis, дана оценка токсичности полученных экстрактов, а также исследована их противовирусная активность. Вирус гриппа выращивали в аллантоисной полости куриных эмбрионов. Инфекционный титр вируса гриппа определяли титрованием на куриных эмбрионах, наличие вируса — по реакции гемагглютинирующей активности. Гемагглютини- рующая активность вирусов выявлялась исходя из стандартной методики с применением 0,75 % взвеси куриных эритроцитов. Титр инфекционности вируса рассчитывался с использованием методики Рида и Менча. Главным показателем при исследовании специфического противовирусного эффекта соединений являлся показатель ТИ (терапевтический индекс), определяемый отношением среднетоксичной концентрации вещества (ТК50) к среднеэффективной вирусингибирующей концентрации (ЭК50). Противовирусная активность полученных экстрактов была изучена на модели вирусов гриппа человека, животных и птиц, в интервале доз от 0,025 мкг/мл до 1,25 мкг/мл с использованием методических приёмов «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств». При исследовании 3-х полученных экстрактов ксилофитных грибов на острую токсичность было установлено, что все исследуемые соединения грибов, при однократном внутрижелудочном введении белым беспородным мышам, не проявляли токсического действия в исследуемом интервале доз. При проведении исследования по способности подавления репродукции различных штаммов вируса гриппа было выявлено, что экстракты грибов Auricularia auricula-judae и Tremella fuciformis обладают выраженными противовирусными свойствами и превосходят по показателю химико-терапевтического индекса коммерческие противогриппозные препараты.

Введение

Вирус гриппа является самым известным и широко распространенным возбудителем заболеваний из сотни вирусов, поражающих верхние дыхательные пути. Эпидемии гриппа носят сезонный характер, способны поражать до 20 % жителей и уносить 25 000–50 000 человеческих жизней в год [1]. Вирус гриппа А способен образовывать точечные мутации в двух поверхностных гликопротеинах (гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA)), в связи с этим он обретает способность обходить защитные механизмы иммунной системы человеческого организма [2].

Перед инфекционистами и фармакологами стоит задача — обеспечить контроль над инфекцией вируса, которую можно решить посредством применения вакцин и противовирусных препаратов. Кроме высокой результативности и хорошей переносимости, новые противовирусные препараты должны иметь широкий спектр действия, действовать на лекарственно-устойчивые штаммы.

Ввиду недостаточной эффективности существующих противовирусных лекарственных средств, а также их возможной токсичности ученые-вирусологи всего мира вынуждены проводить исследования для поиска новых, более перспективных препаратов. Важное значение имеет не только аспект поиска принципиально новых механизмов действия соединений, но и источник их происхождения. Одним из актуальных направлений исследований в последнее время является создание довольно перспективных лекарственных средств, полученных на основе биологически активных соединений растительного или микробного происхождения [3–5].

Несмотря на многочисленные исследования в направлении создания безопасных и эффективных противовирусных препаратов, в терапии грипозной инфекции применяются лишь отдельные препараты, такие как Тамифлю, Ремантадин, Рибавирин, Ксофлюза, Азидотимидин [6–8]. Одной из сложнейших целей является поиск антивирусных препаратов, способных блокировать вирус гриппа, не повреждая структуру клетки организма-хозяина. По этой причине результаты многолетних поисков противовирусных веществ оказались весьма скудными, остались на уровне открытия лишь единичных химиопрепаратов, имеющих узкий спектр действия. Мало изучены механизмы взаимодействия антивирусных препаратов с мишенями клетки-хозяина, связь между антивирусной активностью и структурными параметрами лекарств.

Лекарственные свойства высших грибов известны с древних времен. К завершению ХХ столетия был накоплен опыт, показывающий, что грибы, ввиду биохимических особенностей, являются одними из основных продуцентов в биотехнологии, способны стать заменой бактериям и растительным объектам [9, 10], в том числе как источники сырья для создания препаратов, имеющих ранозаживляющий, иммуномодулирующий, противовирусный и антираковый эффект [11–14].

Цель нашего исследования — изучить противовирусную активность некоторых ксилофитных съедобных грибов.

Материалы и методы

Вирус гриппа. В экспериментальных исследованиях был использован эпидемически значимый штамм вируса гриппа человека А/Алматы/8/98 (H3N2), вирус гриппа человека (пандемический вариант, устойчивый к тамифлю) А/Владивосток/2/09 (H1N1), вирус гриппа птиц, A/FPV/36/1 (H7N1).

В работе рассматривались экстракты некоторых съедобных грибов (табл. 1).

Таблица 1

Представители некоторых порядков базидиальных грибов, задействованных в эксперименте

Культивирование вируса осуществляли на модели куриных эмбрионов в течение 24–48 ч при 37 °С. Для экспериментов использовали аллантоисный вирус в дозе 10⁸–10⁹ ЭИД50/мл. Инфекционный титр вируса гриппа определяли методом предельных разведений по методу Рида и Менча [15]. Наличие вирусов определяли гемагглютинирующим способом при использовании эритроцитов курицы или морской свинки [15].

Мицелий грибов после отмывки среды подвергали спиртовой экстракции с последующим лиофильным обезвоживанием.

Токсичность и специфическая противовирусная активность исследуемых экстрактов была изучена согласно методическим указаниям «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [16] с расчётом химико-терапевтического индекса (ХТИ), выявляемого отношением среднетоксичной концентрации вещества (ТК50) к среднеэффективной вирусингибирую- щей концентрации (ЭК50).

Острая токсичность определялась с использованием методики «доза–эффект», после внутриже- лудочного введения готовых экстрактов, аутбредным лабораторным мышам, в разных вариантах дозировок. Учёт результатов проводился согласно Методическим рекомендациям [16–18].

Вирусингибирующие свойства анализируемых препаратов изучали методом построения кривых «доза–активность» [18].

Статистическая обработка была проведена с использованием пакета программ «Microsoft Office». Для табличного и графического изображений полученных результатов использовалась программа Microsoft Office Excel.

Результаты и их обсуждение

Острую токсичность 3-х полученных экстрактов грибов изучали на модели белых беспородных мышей. Отобранные препараты вводили внутрижелудочно с помощью специализированного металлического атравматического зонда в максимально допустимом объеме для мышей весом 18–20 г (0,5 мл). Мышам в контрольной группе вводили фосфатный буфер в аналогичном объеме. Доза для всех препаратов составляла 1, 3, 5 мг.

Наблюдение за животными осуществляли в течение 2-х недель. При вскрытии мышей патологических изменений в органах и тканях, вызванных воздействием исследуемых препаратов, не обнаружено. Установлено, что все исследуемые соединения при однократном внутрижелудочном введении не проявляли токсического действия в исследуемом интервале доз.

Согласно «Согласованной на глобальном уровне системе классификации опасности и маркировки химической продукции» (СГС) (IV пересм. изд., ООН, 2011 г.), исследуемые противовирусные препараты можно отнести к V классу — «Малотоксичные препараты».

Таким образом, при выявлении острой токсичности на модели белых беспородных мышей показано, что полученные экстракты грибов не проявляли острой токсичности при однократном внутри- желудочном введении в дозе до 5 мг.

Изучение противовирусной активности полученных на модели вирусов гриппа человека животных и птиц проводили в интервале доз от 0,025 мкг/мл до 1,25 мкг/мл согласно методическим приемам «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [18].

На рисунке представлены результаты способности исследуемых экстрактов грибов подавлять репродукцию вирусов. Показано, что все исследуемые экстракты съедобных грибов способны в заданном интервале доз полностью блокировать воспроизводство вируса гриппа независимо от его антигенной структуры. При этом максимальной активностью обладали экстракты Auricularia auricula- judae и Tremella fuciformis.

Сравнительное изучение противовирусного действия 2-х отобранных экстрактов в сопоставлении с противовирусной активностью коммерческих противогриппозных синтетических препаратов — Осельтамивир (Тамифлю) и Ремантадин при испытании на различных штаммах вируса гриппа представлено в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительная оценка ХТИ грибных экстрактов и коммерческих препаратов с противовирусной активностью

В результате сравнительного изучения показателей ХТИ установлено, что исследуемые экстракты грибов превосходят по показателю ХТИ коммерческие противогриппозные препараты при тестировании на различных штаммах вируса.

Заключение

Поиск соединений растительного происхождения, способных подавлять репродукцию вирусов, остается весьма перспективным направлением научных исследований. Это можно объяснить рядом причин, главными из которых являются доступность сырья и низкая токсичность. В наших исследованиях изучена возможность применения экстрактов некоторых съедобных грибов подавлять репродукцию вирусов гриппа.

Показано, что экстракты грибов Auricularia auricula-judae и Tremella fuciformis обладают выраженными противовирусными свойствами, сопоставимыми с коммерческими препаратами.

По оси ординат — подавление репродукции в %, по оси абсцисс — доза препарата, мкг/мл

Рисунок. Изучение дозозависимого эффекта вирусингибирующей активности исследуемых препаратов
на модели вируса гриппа человека (пандемический вариант, устойчивый к Тамифлю)

Работа выполнена в рамках проекта грантового проекта Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан № АР08855630.

56 Вестник Карагандинского университета

Список литературы

1. World Health Organization (WHO), World Health Statistics 2018. Электронный ресурс. URL: http://www.who.int/whosis/whostat/EN_WHS2018_TOC.pdf (дата обращения: 10.11.2020).
2. Influenza Antiviral Drug Resistance. Centers for Disease Control and Prevention. Электронный ресурс. URL: https://www.cdc.gov/flu/about/qa/antiviralresistance.htm (дата обращения: 10.11.2020).
3. Teplyakova T.V. Antiviral activity of polyporoid mushrooms (higher basidiomycetes) from Altai mountains (Russia) / T.V. Teplyakova, N.V. Psurtseva, T.A. Kosogova, N.A. Mazurkova, V.A. Khanin, V.A. Vlasenko // Int. J. for Med. Mushrooms. — 2012. — Vol. 14 (1). — P. 37–45. https://doi.org/10.1615/intjmedmushr.v14.i1.40
4. Sanghai Vaijwade D.N. Screening оf antiviral compounds from plants — a review / D.N. Sanghai Vaijwade, S.R. Kulkarni, N.N. Sanghai // Journal of Pharmacy Research. — 2014. — Vol. 8(8). — Р. 1050–1058. http://jprsolutions.info
5. Lin L.T. Antiviral Natural Products and Herbal Medicines / L.T. Lin, W.Ch. Hsu, Ch. Ch. Lin // J Tradit Complement Med. — 2014. — Vol. 4, No. 1. — Р. 24–35. https://doi.org/10.4103/2225–4110.124335
6. Magano J. Synthetic approaches to the neuraminidase inhibitors zanamivir (Relenza) and oseltamivir phosphate (Tamiflu) for the treatment of influenza / J. Magano // Chemical Reviews. — 2009. — Vol. 109, No. 9. — P. 4398–4438. https://doi.org/10.1021/cr800449m
7. Pagadala N.S. AZT acts as an anti-influenza nucleotide triphosphate targeting the catalytic site of A/PR/8/34/H1N1 RNA dependent RNA polymerase / N.S. Pagadala // J Comput Aided Mol Des. — 2019. — Vol. 33, No. 4. — P. 387–404. https://doi.org/10.1007/s10822-019-00189-w
8. Noshi T. In vitro characterization of baloxavir acid, a first-in-class cap-dependent endonuclease inhibitor of the influenza virus polymerase PA subunit / T. Noshi, M. Kitano, K. Taniguchi, A. Yamamoto, Sh. Omoto, K. Baba, T. Hashimoto, K. Ishida, Y. Kushima, K. Hattori, M. Kawai, R. Yoshida, M. Kobayashi, T. Yoshinaga, A. Sato, M. Okamatsu, Y. Sakoda, H. Kida, T. Shishido, A. Naito // Antiviral Res. — 2018. — Vol. 160. — P. 109–117. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.10.008
9. Lindequist U. The Pharmacological Potential of Mushrooms / U. Lindequist, T.H.J. Niedermeyer, W.D. Jülich // Evid Based Complement Alternat Med. — 2005. — Vol. 2, No. 3. — Р. 285–299. https://doi.org/10.1093/ecam/neh107
10. Кароматов И.Д. Грибы — лечебные свойства (обзор литературы) / И.Д. Кароматов, Ш.К. Такаева // Биология и интегративная медицина. — 2019. — № 11 (39). — С. 72–131.
11. Quang D.N. Inedible mushrooms: a good source of biologically active substances / D.N. Quang, T. Hashimoto, Y. Asakawa // Chem Rec. — 2006. — Vol. 6, No. 2. — Р. 79–99. https://doi.org/10.1002/tcr.20074
12. Chunchao H. A Hypothesis: Supplementation with Mushroom-Derived Active Compound Modulates Immunity and Increases Survival in Response to Influenza Virus (H1N1) Infection / H. Chunchao, J. Guo // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. — 2010. — Vol. 2011. Article ID 252501, 3 pages. http://dx.doi.org/10.1093/ecam/neq037
13. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides / S.P. Wasser // Appl Microbiol Biotechnol. — 2002. — Vol. 60. — Р. 258–274. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-002-1076-7
14. Ivanova T.S. Anticancer Substances оf Mushroom Origin / T.S. Ivanova, T.A. Krupodorova, V.Y. Barshteyn, A.B. Artamonova, V.A. Shlyakhovenko // Experimental Oncology. — 2014. — Vol. 36. — Р. 58–66.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24980757/

1. Balammal G. Analysis of herbal medicines by modern chromatographic techniques / G. Balammal, M. Sekar Babu, P. Jayachandra Reddy // International Journal of Preclinical and Pharmaceutical Research. — 2012. — Vol. 3, No. 1. — P. 50–63.
2. Aminoff D. Method for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids / D. Aminoff // Biochem. Journal. — 1961. — Vol. 81. — P. 384–392.
3. Klimov A. Influenza virus titration, antigenic characterization, and serological methods for antibody detection / A. Klimov, A. Balish, V. Veguilla, H. Sun, J. Schiffer, X. Lu, J.M. Katz, K. Hancock // Influenza Virus. — 2012. — Vol. 865. — Р. 25–51. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-621-0_3
4. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с.