Выбор условий культивирования родиолы розовой (rhodiola rosea l.) in vitro

Аннотация

Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть биомассы можно использовать для экстракции целевого продукта, а часть пересаживать на свежую питательную среду для возобновления культуры. В работе проведены исследования по выбору оптимальных условий культивирования лекарственного растения, занесенного в Красную книгу Республики Казахстан Родиолы розовой (Rhodiolarosea L.), а также определение количественного содержания салидрозида. Целью исследования является получение лекарственного растенияРодиола розовая, биотехнологическим методом. В качестве питательной среды будет использоваться среда Мурасиге-Скуга, которая была разработана физиологами растений ТошиоМурасиге и Фольке К. Скугом в 1962. Используя данную среду можно добиться существенного ускорения роста по сравнению с другими питательными средами.

Ключевые слова: биотехнология, Родиола розовая, питательная среда, стерильность, культивирование.

Культивирование растений in vitro имеет колоссальный потенциал для производства ценных биологически активных веществ для различных методов применения. Уровень развития этой технологии быстро прогрессирует, что подчеркивается многими имеющимися методами, направленными на биотехнологическое использование. Это обещает введение новой фазы развития в фармацевтической, косметической и пищевой промышленностях, а также в сельском хозяйстве [1].

Преимущества состоят в следующем:

• Культивирование независимо от территориальных и сезонных условий
• Культивирование растительных клеток, сложно культивируемых растений, например, растений из экстремальных районов
• Культивирование растений, внесенных в «Красную книгу»
• Культивирование растений с изменениями путем генной инженерии без высадки на поле
• Реализация стандартизированного постоянного качества.

Привлечение методов биотехнологии, базирующихся на культивировании изолированных органов, тканей и клеток растений для решения проблем сохранения биологического разнообразия имеет преимущества перед традиционно используемыми подходами [2].

Сохранение биологического разнообразия - одна из важнейших задач в деле охраны природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения. Наряду с традиционными способами сохранения растенийвсе большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов [3].

Методы биотехнологии позволяют::

• получать оздоровленный материал от пораженных вирусными и грибными болезнями растений;
• осуществлять быстрое размножение ценного экземпляра растения;
• получать в больших количествах вегетативное потомство трудно размножаемых в обычных условиях видов и форм растений;
• работать в лабораторных условиях круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку;
• длительно хранить пробирочные растения и создавать «банк» ценных форм [4].

В настоящее время возрастает интерес к использованию растений родиолы розовой (Rhodiolarosea L.) в составе общеукрепляющих и тонизирующих средств, которые находят все более широкое применение в восстановительной, спортивной медицине и гериатрии [10]. Рост популярности данного вида растений среди населения приводит к увеличению сбора подземной части растений и, как следствие этого, истощению природных популяций. Вид Rhodiolarosea включен в Красную книгу Республики Казахстан [7]. Таким образом, сохранение генетического разнообразия природных популяций родиолы розовой и обеспечение фармацевтической промышленности этим видом растительного сырья может быть достигнуто путем организации производственных плантаций (оранжереи, ботанических садов) [10]. Однако при организации укрупненных плантаций этот путь является весьма трудоемким и медленным. Основной проблемой, при выращивании растений из семян, является их низкая всхожесть и массовая гибель проростков. Для достижения растениями имматурного возрастного состояния требуется около двух лет, после чего растения могут быть пересажены в открытый грунт. Весьма перспективным путем массового получения посадочного материала является использование метода биотехнологии растений [11].

Целью исследования является получение лекарственного растения Родиола розовая, биотехнологическим методом.

Методы.Объектами исследований выбраны: наземные части растения: стебли, листья лекарственного растения Родиола розовая (Rhodiolarosea L.) для проращивания. В качестве питательной среды для проращивания культуры растения нами выбрана среда Мурасиге-Скуга (MS).

Подготовка посуды, инструментов. Посуда для приготовления и хранения питательных сред, культивирования растительного материала тщательно моется. Посуда моется моющими средствами, полоскать ее следует не менее 10 раз водопроводной водой и 3-мя порциями дистиллированной воды. После мытья посуду просушивают в сушильном шкафу при 160 С в течение 2 часов. Непосредственно перед работой инструменты погружают в 96 % раствор этилового спирта и прожигают их рабочие поверхности над пламенем спиртовки [1,2,4].

Приготовление питательной среды. Питательные среды для культур изолированных тканей имеют сложный состав. Основой всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь 6 минеральных солей. К необходимым макроэлементам относят азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо, а к микроэлементам - бор, марганец, цинк, медь, молибден, кобальт и др. В состав питательных сред обязательно входит этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или ее натриевая соль (Nа2ЭДТА), которые улучшают доступность железа. В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы. В качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 20-30 г/л. Для стимуляции биохимических процессов в клетке используют витамины группы В: тиамин-НС 1 (В1), рибофлавин (В2), Са-пантогенат (В5), пиридоксин- HCl (В6), аскорбиновая кислота (С), никотиновая кислота (РР), мезоинозит. Для процессов роста и морфогенеза в культуре тканей необходимы регуляторы роста и развития - фитогормоны. Эти вещества индуцируют деление и растяжение клеток, влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей. В биотехнологических исследованиях чаще используют фитогормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины. Среды стерилизуют автоклавированием при давлении 0,8-1 атм. После окончания автоклавирования следует медленно снижать давление в автоклаве и открывать его крышку лишь после того, как внутреннее давление станет равно внешнему. В противном случае из-за резкого изменения давления жидкость в сосудах бурно вскипает, что может привести к выбросу пробок. Чтобы убедиться в отсутствии бактериального заражения, культуральные сосуды с питательной средой оставляют на 4 -6 дней при температуре 20-25 °С. Сосуды с зараженной средой необходимо немедленно удалять для избежания заражения воздуха в лабораторном помещении [2,4,5].

Правила стерилизации растительного материала. Поверхностные покровы всех органов растений обычно заражены спорами микроорганизмов и грибов, тогда как внутренние ткани здоровых, неповрежденных растений считаются стерильными. Дли поверхностной стерилизации растительных тканей применяют соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия, гипохлорит калия, хлорная известь, хлорамин), ртуть (сулема, диацид), перекись водорода, этиловый спирт. Прежде чем приступить к стерилизации, необходимо подготовить 4 стерильных сосуда с крышками. Один из них заполняют стерилизующим раствором, остальные - стерильной водой. Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный материал помещают на несколько секунд в 96 % этиловый спирт, затем в стерилизующий раствор и отмечают время начала стерилизации. Растительный материал, погруженный в стерилизующий раствор, вносится в ламинар-бокс. По истечении времени стерилизации растительный материал стерильным пинцетом переносят в сосуды со стерильной водой, выдерживая в каждом из них по 5 мин. Простерилизованные и промытые объекты, помещенные в стерильные чашки Петри, готовы для вычленения фрагментов тканей и переноса их на питательные среды [5,6].

После подготовки рабочего места, посуды, питательной среды и растительного материала нами были посажены наземные части (простерилизованные, разрезанные на небольшие доли размерами около 7мм*6мм Родиолы розовой в количестве 80 пробирок на питательную средуMS. Пробирки поместили в термостат, где соблюдали условия (температуры не более 25 С, света) для проращивания эксплантов. Через 72-96 часов после посадки зараженные пробирки с питательными средами и посаженными эксплантами удалили. Экспланты проращивали в течении месяца при постоянном наблюдении [5,6].

Через месяц в пробирках с посаженными эксплантамиполучили проростки исследуемого растения размером 3-4 см. Проростки Родиолы розовой использовались для определения салидрозида спектрофотометрическим способом.

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавили 10 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут.

Затем извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавили 10 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут.

Далее извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, избегая попадания частиц сырья на фильтр. Экстракцию повторяли еще 3 раза по 10 мл воды, нагревая каждый раз в течение 10 минут и фильтруя в ту же мерную колбу.

К охлажденному фильтрату прибавили 6 мл 10 % раствора свинца ацетата, 2 мл насыщенного раствора натрия сульфата, тщательно перемешивали, доводят объем раствора водой до метки и фильтровали через бумажный фильтр. Первые 15 мл фильтрата отбрасывали.

В мерную колбу вместимостью 25 мл перенесли 5 мл полученного фильтрата, прибавили 2,5 мл 2 % раствора натрия карбоната, 2,5 мл диазотированного сульфанила, довели объем раствора водой до метки, перемешали и через 5 минут измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 486 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения воду [10,11,12].

Содержание салидрозида в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

Х = D * 250 * 100 / 253 * m * (100 - W)

• де: D - оптическая плотность анализируемого раствора;

253 - удельный показатель поглощения салидрозида;

m - масса сырья в граммах;

W- потеря в массе при высушивании сырья, в процентах [12].

Заключение. Нами установлено количественное содержание салидрозидав нативном растении Родиолы розовой в пересчете на сухое сырье, которое оказалось в пределах 0,9–1,2 %,а в проростках Родиолы розовой полученных биотехнологическим методом в пересчете на сухое сырье, которое оказалось в пределах 1,5-1,8 %.

Количественное определение в корневищах и корнях родиолы розовой по рекомендации ГФ XI должно быть не менее 0,8 % [9].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание салидрозида в проростках Родиолы розовой, полученных биотехнологическим методом (проращивание в стерильных условиях на среде Мурасиге- Скуга), почти в 2 раза превышает его содержание в нативном растении Родиолы розовой.

Литература

1. Бутенко Р. Г Культура клеток растений и биотехнология. - М. : Наука, 1986. - 28 с.
2. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. - 152 с.
3. Биотехнология / Джесси Рассел. - М.: VSD, 2012. - 173 c.
4. Р. В. Камелин (эскизы к портрету учителя), 1997
5. Лутова, Л. А. Биотехнология высших растений / Л.А. Лутова. - М.: Издательство СПбГУ, 2010. - 240 c.
6. Валиханова Г. Ж., Рахимбаев И. Р. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре тканей растений. - Алма-Ата :КазГУ, 1983.- 152 с.
7. Беккер, М.Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Беккер. - М.: Книга по Требованию, 2012.
8. Arakawa T., Chong D.K.X., Merritt J.L., Langridge W.H.R. Expression of Cholera Toxin B Subunit Oligomers in Transgenic Potato Plants // Transgenic Res. 1997. Vol. 6. P. 403-414.
9. Государственная фармакопея Республики Казахстан. Т.1.-Алматы:Издательский дом «Жибекжолы», 2008. - 592 с.
10. Саратиков А.С., Краснов Е.А. Родиола розовая - ценное лекарственное растение: золотой корень. - 3-е изд. испр. и доп. - Томск, 1987. - 254 с.
11. Куркин, В.А. Химический состав и фармакологические свойства растений рода родиола (обзор) / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная // Хим.-фармац. журнал. 1986. Т. 20, № 10. С. 1231-1244.
12. Крендаль Ф.П., Козин С.В., Левина Л.В. Сравнительная характеристика препаратов из группы фитоадаптогенов- женьшеня, элеутерококка и родиолы розовой. М.: ПРОФИЛЬ. 2007. 392 с