Сравнительная характеристика аминокислотного и полисахаридного состава листьев и цветоложа cynarascolymusl

Резюме

Изучен аминокислотный и полисахаридный состав листьев и цветоложаCуnarascolymusL выращиваемого в Узбекистане. Установлено, что в белках из листьев преобладают свободные аминокислоты, в белках цветоложе – связанные. Выделены водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы, получен их сравнительный моносахаридный состав. Содержание белка в листьях - 8,64%, а в цветоложе – 8,4%. В белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор незаменимых аминокислот. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные. Молекулярная масса гетерогенных белковых компонентов от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа. По данным масс-спектрального анализа цветоложа обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена, сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, пальмитиновая кислота и высшие углеводороды и их производные.

Ключевые слова:CуnarascolymusL., цветоложе, листья, свободные и связанные аминокислоты, полисахариды, ИК-спектроскопия.

Артишок колючий (CуnarascolymusL.) относительно новое растения для Узбекистана. В составе данного растения содержатся ряд биологически активных веществ определяющих его лечебные свойства. Лекарственные препараты на основе артишока колючего проявляют широкий спектр фармакологического действия, как гепатопротекторное, желчегонное, гипохолестеринемическое, противоатерослеротическое и др. [2,4]. Спектр такой биологической активности служит причиной пристального изучения вышеуказанного растения.

Целью данного исследования является сравнительное изучение аминокислотного и полисахаридного состава листьев и цветоложа артишока колючего выращиваемого в Узбекистане.

Материалы и методы. Выделение белка из объектов проводили экстракцией 0,2 Н гидроокисью натрия мелкоизмельченного сырья на магнитной мешалке при 500 об/мин при соотношении 1:10 в течение 1 часа. Полученный экстракт центрифугировали на рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин. В полученном супернатанте проводили осаждение сухим 60% сульфатом аммония (100 мл 36,88 г (NH)4SO4) и оставляли на 16 часов в холодильнике для формирования белка. Затем экстракт центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученный осадок растворяли в 0,2 Н гидроокиси натрия и определяли в растворе количественное содержание белка спектрофотометрическим методом Каркалья [2].

Определение аминокислотного состава проводили следующим образом: точную навеску протеина (50 мг) гидролизовали 5,7 Н серной кислотой при 110°С в течение 24 ч в вакуумных условиях. Гидролизаты упаривали и передавали на аминокислотный анализатор марки Т-339 (Microtechna- Prague) с программным управлением.

Определение молекулярной массы белковых фракций проводили методом ВЭЖХ на приборе AgilentTechnologies 1100 серии с использованием дегазатора G1322A, насоса для подачи растворителей 1311А, автосамплера G1313A, термостата колонки G1316A и диодноматричного детектора DADG 1315B. Колонка ZorbaxGF-250; 4,6x250 мм, 4 μm с использованием предколонки Zorbaxdiol; 4,6х12,5 мм 5 μm. Подвижная фаза: 0,1 М раствора натрий фосфатного буфера (pH=7), содержащий 0,1% SDS, скорость потока - 0,25 мл/мин, термостатирование колонки при температуре 50ºС, концентрация белков в растворе - 5 мг/мл, детектирование пиков при длине волны 210 нм. Для определения молекулярной массы белков колонка предварительно была откалибрована при помощи стандартных растворов белков с известной молекулярной массой: иммуноглобулина (160 кДа), обычного сывороточного альбумина (67 кДа), овальбумин (45 кДа), ингибитора трипсина (20 кДа). Молекулярную массу определяли путем построения калибровочного графика, используя в качестве параметров зависимость логарифма молекулярной массы белков от их объема удерживания.

Масс-спектральный анализ цветоложа проводился на хромато-масс-спектрометре «AgilentTechnology» GС/МS АТ 5973N, с применением капиллярной колонки размером 30м×0,25 мм с 5% фенилметилсилоксана при температуре инжектора 280⁰С, при программировании температуры термостата колонки от 80 до 280⁰С, величина пробы 1 мкл. Цветоложа измельчали,заливали 15 мл толуола и оставляли на 12 часов, толуол сливали и концентрировали до 1 мл.

Нисходящую бумажную хроматографию выделенных фракций полисахаридов проводили, применяя хроматографическую бумагу Filtrak-FN 18 в системе растворителей бутанол-1-пиридин-вода (6:4:3), для идентификации пятен использовали кислый фталат анилина (гексозы и пентозы) и 5% -ный раствор мочевины (кетосахара).

ВРПС гидролизовали 1Н H2SO4 в течение 8 ч при 100°С, ПВ и ГМЦ -2Н H2SO4 в течение 20 ч при 100°С), нейтрализовали карбонатом бария, деминерализовали с помощью катионита КУ-2 в Н⁺- форме. Далее проводили идентификацию моносахаридов БХ методом, сопоставляя со стандартными образцами. Соотношение моносахаридов анализировали методом ГЖХ в виде ацетатов альдонитрилов. Хроматограмму регистрировали на хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором, колонка из нержавеющей стали (200 х 0,3 см), 5 % Silicone ХЕ - 60 на хроматоне NAW - 0,200 - 0,250 меш., температура термостата - 210ºС, температура детектора - 280ºС, газ-носитель - азот, скорость газа - 60 мл/мин.

Количество галактуронового ангидрида определяли фотоэлектроколо-риметрическим методом на основе цветной реакции с карбазолом [ 1,3].

Количественные характеристики ПВ установили титриметрическим методом [1,3]. Вязкость растворов полисахаридов измеряли в вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,73 мм.

ИК-спектры образцов снимали на ИК-спектрометре фирмы Perkin-Elmer, модель 2000, в таблетках прессованных с KBr. Инактивацию сырья проводили следующим образом: 100г измельченного сырья (листья, цветоложа по отдельности) обрабатывали кипящим хлороформом (1:5) в течение 1 ч дважды. Сырье отделяли и высушивали.

Выделение спирторастворимых сахаридов (СРС). Остаток сырья экстрагировали кипящим 82° спиртом дважды по 1 ч. Экстракты отделяли, упаривали и хроматографировали.

Экстракция ВРПС. Остаток сырья экстрагировали водой комнатной температуры в течение 1 ч, дважды при гидромодуле 1:4, 1:2. Экстракты объединяли, упаривали и осаждали спиртом 1:4. осадок ВРПС-Х отделяли центрифугированием, промывали и высушивали спиртом. ВРПС-Г выделяли аналогично при 75-80°. Выход и моносахаридный состав представлены в табл.1.

Выделение ПВ. Остаток сырья обрабатывали смесью 0,5-ных растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония (1:1) при 80-85° в течение 2 ч при гидромодуле 1:8. Экстракты отделяли фильтрованием, диализовали против проточной воды, осаждали спиртом 1:4. Выпавший осадок ГВ отделяли, высушивали спиртом.

Экстракция ГМЦ. После извлечения ПВ сырье экстрагировали дважды 5%-ным раствором КОН (1:3, 1:2) при комнатной температуре в течение 2 ч. Экстракты отделяли, нейтрализовали СН3СООН, диализовали, упаривали и осаждали спиртом (1:3), осадок отделяли, высушивали спиртом.

Таблица 1-Состав и содержание свободных и связанных аминокислот листьев и цветоложа CуnaraScolymusL. (%)

* - незаменимые аминокислоты

Результаты и их обсуждения. Содержание белка в листьях составило - 8,64%, а в цветоложе –

8,4%. Полученные белковые растворы диализовали в проточной воде в течение 24 часов. Обессоленные растворы лиофильно сушили. Брали точную навеску (50 мг) белковых образцов из листьев и цветоложа, проводили количественное определение содержания свободных и связанных аминокислот. Сравнительный анализ состава и содержания аминокислот в белках приводится ниже в таблице 1.

Исходя из данных таблицы 1, в белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор таких незаменимых аминокислот, как валин, треонин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилаланин, гистидин, аргинин. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные.

Определена молекулярная масса белковых фракций выделенных из листьев артишока методом ВЭЖХ. Молекулярная масса белковых компонентов негомогенная, а представляет собой гетерогенный белок, состоящий из белковых компонентов с молекулярной массой от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа, как это видно на рис. 1.

Рисунок 1 - Хроматограмма молекулярной массы выделенного белка из листьев артишока колючего

Также нами проведен масс-спектральный анализ цветоложа артишока колючего. В результате анализа в бензиновом экстракте цветоложе артишока были обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена (тетрагидроциклопентадиен, 2- метилиндиен), сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, насыщенная жирноя кислота (пальмитиновая кислота) и высшие углеводороды (трикозан, эйкозан, пентокозан) и их производные.

Далее проводили выделение углеводного комплекса по известной методике [1]. Воздушно-сухое сырье (по отдельности листья и цветоложа) инактивировали кипящим хлороформом для удаления красящих и низкомолекулярных соединений. Экстрагируя остаток сырья последовательно 82° спиртом, водой, смесью 0,57-ных растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония и 5% раствором КОН, получили спирторастворимые сахара (СРС), водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлозу (ГМЦ) соответственно. Водорастворимые полисахариды получали экстракцией холодной и горячей водой и получили ВРПС-Х, ВРПС-Г. Выделенные полисахариды в листьях и цветоложе (или цветах) артишока колючего находятся в различных количествах. Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2-Содержание и моносахаридный состав углеводов листьев и цветоложа CуnarascolymusL.

Данные таблицы 2 показывают, что в листьях содержание ВРПС-Х, ПВ и ГМЦ достаточно высокое, ВРПС-Г содержатся меньше. В гидролизатах выделенных полисахаридов обнаружили кислые и нейтральные полисахариды. Для ПВ характерно преобладание уроновых кислот – 73,5%, остальные полисахариды также содержат в своем составе уроновые кислоты, но в меньших количествах. Нейтральные моносахариды находятся в различных соотношениях.

Все выделенные полисахариды представляют собой аморфные порошки, хорошо растворимые в воде, гемицеллюлозе, в разбавленных щелочах. Водорастворимые образуют вязкие растворы с относительной вязкостью 1% раствора 3,5-4,6. Пектиновые вещества, растворяясь в воде, образуют более вязкие растворы. Наличие метоксильных групп в ПВ является важным показателем, который позволяется отнести изучаемый ПВ к группе высоко- или низкоэтерифицированных.

Для ПВ листьев и цветоложа установили количественные характеристики. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Количественные характеристики пектиновых веществ листьев и цветоложа CуnarascolymusL.

Полученные данные свидетельствуют о высокой степени этерификации изучаемых пектиновых веществ.

Основными по содержанию полисахаридов в цветках являются гемицеллюлозы, их количество достигает 10%.

Все выделенные полисахариды в своем составе содержат как кислые, так и нейтральные моносахариды. По моносахаридному составу ВРПС являются арабиногалактанами, причем кислыми. Пектиновые вещества также содержат, в основном, нейтральные моносахариды: галактозу и арабинозу, кислые – уроновые кислоты. Гемицеллюлозы отличаются высоким содержанием уроновых кислот, ксилозы и галактозы, т.е. основу ГМЦ составляют кислые ксилоны. Таким образом, из цветков и листьев артишока колючего выделен углеводный комплекс. Показано наличие СРС, ВРПС, ПВ и РМЦ (полностью). Дана их качественная и количественная характеристика.

Установлено, что пектиновые вещества являются высокоэтерифицированными.

Выделенные полисахариды в составе имеют остатки уроновых кислот. При этом часть карбоксильных групп метилирована, часть гидроксильных групп может быть ацетилирована. Благодаря такому разнообразию группировать ИК-спектры полисахаридов достаточно сложно.

В ИК-спектрах полисахаридов были обнаружены характерные полосы поглощения.

Цветоложе

ВРПС-Х – 3435, 2879, 1753, 1640, 1622, 1423, 1387, 1267, 1239, 1110, 1012, 890, 815, 690, 618, 532 см^-1; ВРПС-Г – 3432, 2923, 1748, 1643, 1622, 1530, 1362, 1241, 1150, 1060, 1029, 934, 890, 815, 716, 532 см^-1;

ПВ – 3422, 2935, 1744, 1618, 1424, 1370, 1328, 1240, 1148, 1102, 1015, 1046, 954, 889, 832, 759, 635, 533 см^-1;

ГМЦ – 3435, 2924, 1632, 1417, 1314, 1244, 1163, 1093, 1041, 979, 897, 777, 599, 533 см^-1.

Листья

ВРПС-Х –3200-3600, 2941, 1616, 1093-1500, 841 и 875 см^-1.

ВРПС-Г –3364, 2946, 1599, 1413, 1728, 1255, 1096, 1026 см^-1.

ПВ –3482-2918, 1745 и 1645, 1424, 1328-1258, 1149, 1370, 1099 – 1015, 951, 830 см^-1.

ГМЦ –3284-2908, 1671, 1592-1552, 1406, 1315, 1247, 1145-1015, 950, 892, 775см^-1

Сопоставление ИК-спектров полисахаридов листьев и цветоложа показывает, что они во многом совпадают, т.е. имеют одинаковые полосы поглощения, которые различаются интенсивностью и сдвигом в низко- или высокочастотные области. Совпадение основных полос поглощения связано также и с наличием остатков уроновых кислот в изучаемых полисахаридах.

В ИК-спектрах присутствуют полосы поглощения гидроксильных групп 3435-3422 см^-1. Валентные колебания ионизированных групп С=О, связанных с металлами, проявляются в области 1745- 1413 см^-1. Наличие последней, достаточно интенсивной полосы поглощения в ИК-спектре, является характерным для карбоксиполисахаридов, т.е. ПВ это связано также с тем, что основную цепь ПВ составляют остатки галактуроновой кислоты, а боковые ответвления представлены нейтральными сахарами. Благодаря такому разнообразию ИК-спектры ПВ представляют собой сложную картину. Полосы поглощения в области 13281258 см^-1 вызваны колебаниями эфирных и гидроксильных групп. Полоса поглощения 1149 см^-1 показывает наличие этерифицированных групп, а полоса поглощения 1370 см^-1 конкретно указывает, что этерифицированные группы представлены метильной группой. Колебания пиранозных колец отражаются широким диапазоном 1200-1000 см^-1. Деформационные колебания метильных и метиленовых групп проявляются в области 970-951 см^-1. Эта полоса поглощения характерна для ПВ и кислых полисахаридов. Кроме того, эти полисахариды дают в ИК-спектрах такие полосы поглощения 890 см^-1 и 830 см^-1, характеризующие α-1→4гликозидную связь между остатками уроновых кислот, а боковые цепи присоединяются к основной цепи α-гликозидной связью, что соответствует полосе поглощения 777-775 см^-1.

Таким образом, анализ полисахаридов методом ИК-спектроскопии дает информацию о наличии этерифицированных, свободных карбоксильных групп, а также о типе гликозидной связи между моносахаридными остатками.

Выводы. Таким образом, содержание белка в листьях - 8,64%, а в цветоложе – 8,4%.В белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор незаменимых аминокислот. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные. Молекулярная масса гетерогенных белковых компонентов от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа. По данным масс-спектрального анализа цветоложа обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена, сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, пальмитиновая кислота и высшие углеводороды и их производные. В листьях содержание ВРПС-Х, ПВ и ГМЦ достаточно высокое, ВРПС-Г содержатся меньше. В гидролизатах выделенных полисахаридов обнаружены кислые и нейтральные полисахариды. Для ПВ характерно преобладание уроновых кислот – 73,5%. Анализ полисахаридов методом ИК-спектро- скопии дает информацию о наличии этерифицированных, свободных карбоксильных групп, а также о типе гликозидной связи между моносахаридными остатками.

Список литературы

1. Миррахимова Т.А. ИК-спектроскопическое исследование полисахаридного состава листьев Сynarasco-lymusL. /Т.А.Миррахимова, А.Н.Юнусходжаев // Фармацевтический журнал.- Ташкент,2013.- №1.-С.18-22.
2. Миррахимова Т.А., Юнусходжаев А.Н. Изучение липидного и аминокислотного состава листьев артишока колючего // Фармацевтический журнал. -Ташкент, 2013.- №3.- С.23-27.
3. Орловская Т.В. Изучение углеводов Cynara scolymus /Т.В. Орловская, И.Л. Лунева, В.А. Челомбитько //Химия природ. соединений. –Ташкент, 2007. - №1. — С. 89-90.
4. Орловская Т.В. Химический состав листьев Cynara scolymus /Т.В. Орловская, И.Л. Лунева, В.А. Челомбитько //Химия природ. соединений. – Ташкент, 2007. - №2. - С. 197-198.