Сравнительная характеристика аминокислотного и полисахаридного состава листьев и цветоложа cynarascolymusl

Резюме

Изучен аминокислотный и полисахаридный состав листьев и цветоложаCуnarascolymusL выращиваемого в Узбекистане. Установлено, что в белках из листьев преобладают свободные аминокислоты, в белках цветоложе – связанные. Выделены водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы, получен их сравнительный моносахаридный состав. Содержание белка в листьях - 8,64%, а в цветоложе – 8,4%. В белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор незаменимых аминокислот. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные. Молекулярная масса гетерогенных белковых компонентов от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа. По данным масс-спектрального анализа цветоложа обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена, сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, пальмитиновая кислота и высшие углеводороды и их производные.

Ключевые слова:CуnarascolymusL., цветоложе, листья, свободные и связанные аминокислоты, полисахариды, ИК-спектроскопия.

Артишок колючий (CуnarascolymusL.) относительно новое растения для Узбекистана. В составе данного растения содержатся ряд биологически активных веществ определяющих его лечебные свойства. Лекарственные препараты на основе артишока колючего проявляют широкий спектр фармакологического действия, как гепатопротекторное, желчегонное, гипохолестеринемическое, противоатерослеротическое и др. [2,4]. Спектр такой биологической активности служит причиной пристального изучения вышеуказанного растения.

Целью данного исследования является сравнительное изучение аминокислотного и полисахаридного состава листьев и цветоложа артишока колючего выращиваемого в Узбекистане.

Материалы и методы. Выделение белка из объектов проводили экстракцией 0,2 Н гидроокисью натрия мелкоизмельченного сырья на магнитной мешалке при 500 об/мин при соотношении 1:10 в течение 1 часа. Полученный экстракт центрифугировали на рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин. В полученном супернатанте проводили осаждение сухим 60% сульфатом аммония (100 мл 36,88 г (NH)4SO4) и оставляли на 16 часов в холодильнике для формирования белка. Затем экстракт центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученный осадок растворяли в 0,2 Н гидроокиси натрия и определяли в растворе количественное содержание белка спектрофотометрическим методом Каркалья [2].

Определение аминокислотного состава проводили следующим образом: точную навеску протеина (50 мг) гидролизовали 5,7 Н серной кислотой при 110°С в течение 24 ч в вакуумных условиях. Гидролизаты упаривали и передавали на аминокислотный анализатор марки Т-339 (Microtechna- Prague) с программным управлением.

Определение молекулярной массы белковых фракций проводили методом ВЭЖХ на приборе AgilentTechnologies 1100 серии с использованием дегазатора G1322A, насоса для подачи растворителей 1311А, автосамплера G1313A, термостата колонки G1316A и диодноматричного детектора DADG 1315B. Колонка ZorbaxGF-250; 4,6x250 мм, 4 μm с использованием предколонки Zorbaxdiol; 4,6х12,5 мм 5 μm. Подвижная фаза: 0,1 М раствора натрий фосфатного буфера (pH=7), содержащий 0,1% SDS, скорость потока - 0,25 мл/мин, термостатирование колонки при температуре 50ºС, концентрация белков в растворе - 5 мг/мл, детектирование пиков при длине волны 210 нм. Для определения молекулярной массы белков колонка предварительно была откалибрована при помощи стандартных растворов белков с известной молекулярной массой: иммуноглобулина (160 кДа), обычного сывороточного альбумина (67 кДа), овальбумин (45 кДа), ингибитора трипсина (20 кДа). Молекулярную массу определяли путем построения калибровочного графика, используя в качестве параметров зависимость логарифма молекулярной массы белков от их объема удерживания.

Масс-спектральный анализ цветоложа проводился на хромато-масс-спектрометре «AgilentTechnology» GС/МS АТ 5973N, с применением капиллярной колонки размером 30м×0,25 мм с 5% фенилметилсилоксана при температуре инжектора 2800С, при программировании температуры термостата колонки от 80 до 2800С, величина пробы 1 мкл. Цветоложа измельчали,заливали 15 мл толуола и оставляли на 12 часов, толуол сливали и концентрировали до 1 мл.

Нисходящую бумажную хроматографию выделенных фракций полисахаридов проводили, применяя хроматографическую бумагу Filtrak-FN 18 в системе растворителей бутанол-1-пиридин-вода (6:4:3), для идентификации пятен использовали кислый фталат анилина (гексозы и пентозы) и 5% -ный раствор мочевины (кетосахара).

ВРПС гидролизовали 1Н H2SO4 в течение 8 ч при 100°С, ПВ и ГМЦ -2Н H2SO4 в течение 20 ч при 100°С), нейтрализовали карбонатом бария, деминерализовали с помощью катионита КУ-2 в Н+- форме. Далее проводили идентификацию моносахаридов БХ методом, сопоставляя со стандартными образцами. Соотношение моносахаридов анализировали методом ГЖХ в виде ацетатов альдонитрилов. Хроматограмму регистрировали на хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором, колонка из нержавеющей стали (200 х 0,3 см), 5 % Silicone ХЕ - 60 на хроматоне NAW - 0,200 - 0,250 меш., температура термостата - 210ºС, температура детектора - 280ºС, газ-носитель - азот, скорость газа - 60 мл/мин.

Количество галактуронового ангидрида определяли фотоэлектроколо-риметрическим методом на основе цветной реакции с карбазолом [ 1,3].

Количественные характеристики ПВ установили титриметрическим методом [1,3]. Вязкость растворов полисахаридов измеряли в вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,73 мм.

ИК-спектры образцов снимали на ИК-спектрометре фирмы Perkin-Elmer, модель 2000, в таблетках прессованных с KBr. Инактивацию сырья проводили следующим образом: 100г измельченного сырья (листья, цветоложа по отдельности) обрабатывали кипящим хлороформом (1:5) в течение 1 ч дважды. Сырье отделяли и высушивали.

Выделение спирторастворимых сахаридов (СРС). Остаток сырья экстрагировали кипящим 82° спиртом дважды по 1 ч. Экстракты отделяли, упаривали и хроматографировали.

Экстракция ВРПС. Остаток сырья экстрагировали водой комнатной температуры в течение 1 ч, дважды при гидромодуле 1:4, 1:2. Экстракты объединяли, упаривали и осаждали спиртом 1:4. осадок ВРПС-Х отделяли центрифугированием, промывали и высушивали спиртом. ВРПС-Г выделяли аналогично при 75-80°. Выход и моносахаридный состав представлены в табл.1.

Выделение ПВ. Остаток сырья обрабатывали смесью 0,5-ных растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония (1:1) при 80-85° в течение 2 ч при гидромодуле 1:8. Экстракты отделяли фильтрованием, диализовали против проточной воды, осаждали спиртом 1:4. Выпавший осадок ГВ отделяли, высушивали спиртом.

Экстракция ГМЦ. После извлечения ПВ сырье экстрагировали дважды 5%-ным раствором КОН (1:3, 1:2) при комнатной температуре в течение 2 ч. Экстракты отделяли, нейтрализовали СН3СООН, диализовали, упаривали и осаждали спиртом (1:3), осадок отделяли, высушивали спиртом.

Таблица 1-Состав и содержание свободных и связанных аминокислот листьев и цветоложа CуnaraScolymusL. (%)

Название аминокислот

Листья артишока

Цветоложе артишока

свободные

связанные

свободные

связанные

Аспарагин

Asp

0,72

0,17

0,51

0,55

Треонин*

Thr

0,28

0,10

0,33

0,24

Серин

Ser

0,29

0,15

0,33

0,33

Глутамин

Glu

1,19

0,52

1,08

1,07

Пролин

Pro

0,20

0,27

0,5

0,58

Глицин

Gly

0,26

0,17

0,31

0,31

Аланин

Ala

0,28

0,20

0,32

0,38

Цистеин

Cys

-

-

-

следы

Валин*

Val

0,27

0,16

0,18

0,34

Метионин*

Met

0,08

0,07

0,06

0,07

Изолейцин*

Ile

0,22

0,10

0,17

0,21

Лейцин*

Leu

0,28

0,28

0,38

0,54

Тирозин

Tyr

0,14

0,09

0,16

0,15

Фенилаланин*

Phe

0,23

0,12

0,17

0,25

Гистидин*

His

0,23

0,10

0,18

0,17

Лизин*

Lys

0,09

0,16

0,20

0,30

Аргинин

Arg

0,23

0,25

0,36

0,57

Сумма аминокислот

∑ 4,99

∑ 2,91

∑ 5,24

∑ 6,06

* - незаменимые аминокислоты

Результаты и их обсуждения. Содержание белка в листьях составило - 8,64%, а в цветоложе –

8,4%. Полученные белковые растворы диализовали в проточной воде в течение 24 часов. Обессоленные растворы лиофильно сушили. Брали точную навеску (50 мг) белковых образцов из листьев и цветоложа, проводили количественное определение содержания свободных и связанных аминокислот. Сравнительный анализ состава и содержания аминокислот в белках приводится ниже в таблице 1.

Исходя из данных таблицы 1, в белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор таких незаменимых аминокислот, как валин, треонин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилаланин, гистидин, аргинин. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные.

Определена молекулярная масса белковых фракций выделенных из листьев артишока методом ВЭЖХ. Молекулярная масса белковых компонентов негомогенная, а представляет собой гетерогенный белок, состоящий из белковых компонентов с молекулярной массой от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа, как это видно на рис. 1.

Рисунок 1 - Хроматограмма молекулярной массы выделенного белка из листьев артишока колючего

Также нами проведен масс-спектральный анализ цветоложа артишока колючего. В результате анализа в бензиновом экстракте цветоложе артишока были обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена (тетрагидроциклопентадиен, 2- метилиндиен), сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, насыщенная жирноя кислота (пальмитиновая кислота) и высшие углеводороды (трикозан, эйкозан, пентокозан) и их производные.

Далее проводили выделение углеводного комплекса по известной методике [1]. Воздушно-сухое сырье (по отдельности листья и цветоложа) инактивировали кипящим хлороформом для удаления красящих и низкомолекулярных соединений. Экстрагируя остаток сырья последовательно 82° спиртом, водой, смесью 0,57-ных растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония и 5% раствором КОН, получили спирторастворимые сахара (СРС), водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлозу (ГМЦ) соответственно. Водорастворимые полисахариды получали экстракцией холодной и горячей водой и получили ВРПС-Х, ВРПС-Г. Выделенные полисахариды в листьях и цветоложе (или цветах) артишока колючего находятся в различных количествах. Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2-Содержание и моносахаридный состав углеводов листьев и цветоложа CуnarascolymusL.

Фракции полисахаридов

Выход (%)

Соотношение моносахаридных остатков в листьях, ГЖХ

галак-тоза

глюкоза

арабиноза

ксилоза

рамноза

уроновые кислоты, %

ВРПС-Х

9,75

10,0

сл.

1,0

1,0

-

8

ВРПС-Г

2,25

1,5

1,0

1,0

1,0

сл.

25,4

ПВ

8,47

2,33

сл.

1,0

сл.

3,08

73,7

ГМЦ

6,67

3,33

сл.

1,0

0,18

сл.

15,8

   

Соотношение моносахаридных остатков в цветоложе, ГЖХ

ВРПС-Х

1,3

4,2

2,5

4,8

1

сл.

28,2

ВРПС-Г

2,3

3,0

1,8

4,5

1

сл.

31,5

ПВ

2,6

4,8

1

3,5

1

1,5

75,3

ГМЦ

10

3,2

1

1

12

1,4

32,5

Данные таблицы 2 показывают, что в листьях содержание ВРПС-Х, ПВ и ГМЦ достаточно высокое, ВРПС-Г содержатся меньше. В гидролизатах выделенных полисахаридов обнаружили кислые и нейтральные полисахариды. Для ПВ характерно преобладание уроновых кислот – 73,5%, остальные полисахариды также содержат в своем составе уроновые кислоты, но в меньших количествах. Нейтральные моносахариды находятся в различных соотношениях.

Все выделенные полисахариды представляют собой аморфные порошки, хорошо растворимые в воде, гемицеллюлозе, в разбавленных щелочах. Водорастворимые образуют вязкие растворы с относительной вязкостью 1% раствора 3,5-4,6. Пектиновые вещества, растворяясь в воде, образуют более вязкие растворы. Наличие метоксильных групп в ПВ является важным показателем, который позволяется отнести изучаемый ПВ к группе высоко- или низкоэтерифицированных.

Для ПВ листьев и цветоложа установили количественные характеристики. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Количественные характеристики пектиновых веществ листьев и цветоложа CуnarascolymusL.

Орган растения

Кс, %

Кэ, %

λ, %

листья

5,2

7,8

60,0

цветоложа

4,5

7,2

61,53

Полученные данные свидетельствуют о высокой степени этерификации изучаемых пектиновых веществ.

Основными по содержанию полисахаридов в цветках являются гемицеллюлозы, их количество достигает 10%.

Все выделенные полисахариды в своем составе содержат как кислые, так и нейтральные моносахариды. По моносахаридному составу ВРПС являются арабиногалактанами, причем кислыми. Пектиновые вещества также содержат, в основном, нейтральные моносахариды: галактозу и арабинозу, кислые – уроновые кислоты. Гемицеллюлозы отличаются высоким содержанием уроновых кислот, ксилозы и галактозы, т.е. основу ГМЦ составляют кислые ксилоны. Таким образом, из цветков и листьев артишока колючего выделен углеводный комплекс. Показано наличие СРС, ВРПС, ПВ и РМЦ (полностью). Дана их качественная и количественная характеристика.

Установлено, что пектиновые вещества являются высокоэтерифицированными.

Выделенные полисахариды в составе имеют остатки уроновых кислот. При этом часть карбоксильных групп метилирована, часть гидроксильных групп может быть ацетилирована. Благодаря такому разнообразию группировать ИК-спектры полисахаридов достаточно сложно.

В ИК-спектрах полисахаридов были обнаружены характерные полосы поглощения.

Цветоложе

ВРПС-Х – 3435, 2879, 1753, 1640, 1622, 1423, 1387, 1267, 1239, 1110, 1012, 890, 815, 690, 618, 532 см-1; ВРПС-Г – 3432, 2923, 1748, 1643, 1622, 1530, 1362, 1241, 1150, 1060, 1029, 934, 890, 815, 716, 532 см-1;

ПВ – 3422, 2935, 1744, 1618, 1424, 1370, 1328, 1240, 1148, 1102, 1015, 1046, 954, 889, 832, 759, 635, 533 см-1;

ГМЦ – 3435, 2924, 1632, 1417, 1314, 1244, 1163, 1093, 1041, 979, 897, 777, 599, 533 см-1.

Листья

ВРПС-Х –3200-3600, 2941, 1616, 1093-1500, 841 и 875 см-1.

ВРПС-Г –3364, 2946, 1599, 1413, 1728, 1255, 1096, 1026 см-1.

ПВ –3482-2918, 1745 и 1645, 1424, 1328-1258, 1149, 1370, 1099 – 1015, 951, 830 см-1.

ГМЦ –3284-2908, 1671, 1592-1552, 1406, 1315, 1247, 1145-1015, 950, 892, 775см-1

Сопоставление ИК-спектров полисахаридов листьев и цветоложа показывает, что они во многом совпадают, т.е. имеют одинаковые полосы поглощения, которые различаются интенсивностью и сдвигом в низко- или высокочастотные области. Совпадение основных полос поглощения связано также и с наличием остатков уроновых кислот в изучаемых полисахаридах.

В ИК-спектрах присутствуют полосы поглощения гидроксильных групп 3435-3422 см-1. Валентные колебания ионизированных групп С=О, связанных с металлами, проявляются в области 1745- 1413 см-1. Наличие последней, достаточно интенсивной полосы поглощения в ИК-спектре, является характерным для карбоксиполисахаридов, т.е. ПВ это связано также с тем, что основную цепь ПВ составляют остатки галактуроновой кислоты, а боковые ответвления представлены нейтральными сахарами. Благодаря такому разнообразию ИК-спектры ПВ представляют собой сложную картину. Полосы поглощения в области 13281258 см-1 вызваны колебаниями эфирных и гидроксильных групп. Полоса поглощения 1149 см-1 показывает наличие этерифицированных групп, а полоса поглощения 1370 см-1 конкретно указывает, что этерифицированные группы представлены метильной группой. Колебания пиранозных колец отражаются широким диапазоном 1200-1000 см-1. Деформационные колебания метильных и метиленовых групп проявляются в области 970-951 см-1. Эта полоса поглощения характерна для ПВ и кислых полисахаридов. Кроме того, эти полисахариды дают в ИК-спектрах такие полосы поглощения 890 см-1 и 830 см-1, характеризующие α-1→4гликозидную связь между остатками уроновых кислот, а боковые цепи присоединяются к основной цепи α-гликозидной связью, что соответствует полосе поглощения 777-775 см-1.

Таким образом, анализ полисахаридов методом ИК-спектроскопии дает информацию о наличии этерифицированных, свободных карбоксильных групп, а также о типе гликозидной связи между моносахаридными остатками.

Выводы. Таким образом, содержание белка в листьях - 8,64%, а в цветоложе – 8,4%.В белках из листьев и цветоложа артишока содержится весь набор незаменимых аминокислот. По сумме аминокислот в листьях артишока преобладают свободные аминокислоты, в то время как в цветоложе – связанные. Молекулярная масса гетерогенных белковых компонентов от 55,6 кДа до 7,7 кДа с единственным пептидом с молекулярной массой 4,0 кДа. По данным масс-спектрального анализа цветоложа обнаружены следующие компоненты: бензиловый спирт, азулен и его производные, производные индена, сиреневый альдегид и производные пирогаллола; тритерпеновый спирт – фитол, пальмитиновая кислота и высшие углеводороды и их производные. В листьях содержание ВРПС-Х, ПВ и ГМЦ достаточно высокое, ВРПС-Г содержатся меньше. В гидролизатах выделенных полисахаридов обнаружены кислые и нейтральные полисахариды. Для ПВ характерно преобладание уроновых кислот – 73,5%. Анализ полисахаридов методом ИК-спектро- скопии дает информацию о наличии этерифицированных, свободных карбоксильных групп, а также о типе гликозидной связи между моносахаридными остатками.

Список литературы

  1. Миррахимова Т.А. ИК-спектроскопическое исследование полисахаридного состава листьев Сynarasco-lymusL. /Т.А.Миррахимова, А.Н.Юнусходжаев // Фармацевтический журнал.- Ташкент,2013.- №1.-С.18-22.
  2. Миррахимова Т.А., Юнусходжаев А.Н. Изучение липидного и аминокислотного состава листьев артишока колючего // Фармацевтический журнал. -Ташкент, 2013.- №3.- С.23-27.
  3. Орловская Т.В. Изучение углеводов Cynara scolymus /Т.В. Орловская, И.Л. Лунева, В.А. Челомбитько //Химия природ. соединений. –Ташкент, 2007. - №1. — С. 89-90.
  4. Орловская Т.В. Химический состав листьев Cynara scolymus /Т.В. Орловская, И.Л. Лунева, В.А. Челомбитько //Химия природ. соединений. – Ташкент, 2007. - №2. - С. 197-198.
Год: 2018
Город: Шымкент
Категория: Медицина