Введение. L-аргинин (2-амино-5-гуанидинвалерианова кислота) - частично-заменимая аминокислота, которая является активным регулятором многочисленных жизненно важных функций организма.
L-аргинин является субстратом для фермента оксид азота синтазы, который отвечает за производство окиси азота (NO) [1], который играет критически важную роль в различных физиологических процессах в организме человека [2]. Определение концентрации L-аргинина в сыворотке крови позволяет диагностировать и изучать особенности течения таких сложных заболеваний, как гепатокарцинома [3], меланома кожи и колоректальный рак [4]. Измерение и контроль концентрации L-аргинина в моче позволяет диагностировать гомозиготную цистинурию [5].
На сегодня определение концентрации L-аргинина в растворах проводят следующими методами: ионообменной хроматографии, флуориметрии, спектрофотометрии, капиллярного, зонного электрофореза, полярографии, проточно-инжекционного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии [4]. Предложенные методы являются достаточно сложными, дорогостоящими и требуют сложной предварительной подготовки проб. На данный момент, актуальна разработка биосенсоров для определения концентрации аргинина в лекарственных препаратах, для проверки их качества и соответствия требованиям производства.
Цель исследования. Разработка кондуктометрического биосенсора на основе уреазы и аргиназы для количественного определения аргинина в биологических жидкостях.
Материалы и методы. В работе использовали кондуктометрический метод анализа. Для разработки аргининовых биосенсоров были использованы кондуктометрические преобразователи на основе двух пар золотых или платиновых электродов. Иммобилизация ферментов и бычьего сывороточного альбумина на поверхности кондуктометрического преобразователя осуществлялась методом сшивания глутаровым альдегидом (ГА). Измерения проводились в дифференциальном режиме, сигналы с ферментной мембраны сравнивались с сигналами полученными из мембраны сравнения, которая содержит только БСА.
Результаты и обсуждение. Для создания аргининовых биосенсоров было проверено несколько типов иммобилизации ферментов: в парах глутарового альдегида, в капли ГА, адсорбция на нитроцеллюлозе, адсорбция на силикалите и фотополимеризация в PVA-SbQ. Оптимальным оказался метод иммобилизации ферментов в капли ГА. Далее была проведена оптимизация выбранного метода, а именно подобраны оптимальные концентрации уреазы, аргиназы, ГА и определена эффективная продолжительность иммобилизации. Для работы со сложными биологическими жидкостями было исследовано влияние параметров раствора (pH буфера, буферная емкость и ионная сила) на работу биосенсора. Кроме того, было показано, что разработанный биосенсор характеризовался хорошей воспроизводимостью сигналов и операционной стабильностью в течение 5 дней. Биосенсорным методом была проведена проверка концентрации аргинина, в лекарственных препаратах, содержащих аргинин в качестве действующего вещества.
Вывод. Разработанный биосенсор для определения концентрации аргинина в лекарственных препаратах. Подобраны оптимальные условия иммобилизации ферментов во время приготовления биосенсоров. Доказана возможность стабильной и воспроизводимой работы предложенного биосенсора со сложными многокомпонентными растворами. Осуществлена проверка лекарственных средств, содержащих аргинин на концентрацию этой аминокислоты. Полученные результаты хорошо коррелируют с заявленными производителями концентрациями аргинина. Соответственно разработан биосенсор для определения аргинина может с успехом использоваться для контроля качества лекарственных средств.
Список літератури
- Marc P. McRae. Therapeutic Benefits of L-Arginine: An Umbrella Review of Meta-analyses. J Chiropr Med. 2016; 15(3):184-9.
- GadMZ. Anti-aging effects of l-arginine. JARE. 2010; 1 : 169-177
- Lam T. L., Wong G. K., Chong H. C. Recombinant human arginase inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest. Cancer Lett. 2009, 277(1)
- Г. З. Гайда , Н. €. Стасюк , М. В. Гончар. Методи аналізу l-аргініну. Biotechnologia Acta. - 2014. - Т. 7, № 1.
- Morales S. M. Cystinuria: diagnosis and therapeutic approach. An Sist. Sanit. Navar. 2011, 34(3)