Методы определения пептидных препаратов в биологических жидкостях

В последнее время разработка лекарственных средств, относящихся к аналогам эндогенных пептидов, является одним из перспективных направлений в области фармации. Лекарственные средства пептидной структуры обладают высокой биологической активностью и селективностью фармакологического действия и применяются при различных заболеваниях сердечно-сосудистой, пищеварительной, эндокринной, иммунной, нервной систем, а также онкологических заболеваниях [1-3]. При проведении биоаналитических исследований пептидных препаратов чаще всего используются такие методы, как иммунохимический анализ, капиллярный электрофорез и виды жидкостной хроматографии, что связано с особенностями строения, химическими и физико-химическими свойствами молекулы [4, 5].

Принцип иммунохимических методов анализа (иммуноферментный анализ - ИФА, радиоиммунологический анализ - РИА) заключается во взаимодействии специфических антител с анализируемым веществом, выступающим в роли антигена. Данный метод обладает высокой чувствительностью (на уровне пг/мл), специфичностью и простотой в использовании. Тем не менее, иммунохимический метод анализа обладает рядом недостатков, которые заключаются в отсутствии абсолютной селективности, перекрестных реакциях с другими веществами пептидной структуры, возможности получение ложноположительных результатов, а все положительные необходимо подтверждать другим методом [5-7].

Аналитические методы, представляющие собой сочетание таких методов разделения, как хроматография или капиллярный электрофорез с УФ-детектированием, имеют ограниченную область применения при анализе биологической жидкости (плазма, сыворотка), так как концентрация анализируемых веществ в таких образцах должна быть крайне высокой, чтобы преодолеть влияние матрицы из-за неселективного обнаружения, тогда как концентрации пептидов в крови обычно находятся на очень низком уровне [8].

В связи с этим, предпочтение в определении пептидных молекул в биологических жидкостях отдается высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс- спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Чаще всего используется метод ионизации электрораспылением в режиме положительной полярности, так как пептиды обычно являются достаточно полярными молекулами, способными легко протонироваться. Как правило, пептиды обнаруживаются при подкислении подвижной фазы почти до 2,0-3,0 для уменьшения полярности пептидной молекулы [9]. Однако в работе Niwa et al. [10] рассматривается пример обнаружения пептида цетрореликса (синтетического декапептида, антагониста гонадотропин рилизинг-гормона) с помощью ионизации электрораспылением в режиме отрицательной полярности [11].

Сложностью при количественном определении пептидов является выбор внутреннего стандарта. Синтез ¹³С- или дейтерированных аналогов является дорогостоящим в случае столь сложных соединений, поэтому в качестве внутреннего стандарта используют структурно родственные аналоги [12].

С целью повышения селективности и качества анализа пептидных препаратов необходимо правильно подобрать хроматографические условия [13]. При разделении пептидов выбор хроматографической колонки определяется размерами и гидрофобностью молекулы. Таким образом, для коротких (до 25 остатков аминокислот), средних (до 50 остатков аминокислот) и преимущественно гидрофильных пептидов, как правило, используют фазы С8-С18, для крупных (более 50 остатков аминокислот) и преимущественно гидрофобных - С3-С6. В большинстве случаев, для разделения крупных пептидов используют обращенные фазы с диаметром пор 300 А [14]. Для оптимизации состава подвижной фазы основополагающее значение имеет правильных выбор рН, концентрации органического компонента и ионов-модификаторов, способных образовывать ионные пары с молекулами веществ [15].

Таким образом, для определения пептидных лекарственных средств в биологических жидкостях, учитывая структуру и физико-химические свойства молекулы, более предпочтительным является метод ВЭЖХ-МС/МС за счет высокой селективности, чувствительности и эффективности. Кроме того, актуально использование специфических колонок, которые подбираются исходя из молекулярной массы и структуры вещества.

Список литературы

1. Craik D., Fairlie D., Liras S. et al. The future of peptide-based drugs // Chem Biol Drug Des. 2013. V. 81. P. 136-147.
2. Beck J. G., Chatterjee J., Laufer B., Kiran M. U., Frank A. O., Neubauer S., Ovadia O., Greenberg S., Gilon C., Hoffman A., Kessler H. Intestinal permeability of cyclic peptides: common key backbone motifs identified // J Am Chem Soc. 2012. V. 134. P. 12125-12133.
3. Хавинсон В.Х., Кветная Т.В. Регуляторные пептиды и гомеостаз // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об- ва им. Д.И.Менделеева). 2005. Т. 49 (1). С. 112-117.
4. John H., Walden M., Schafer S. et al. Analytical procedures for quantification of peptides in pharmaceutical research by liquid chromatography-mass spectrometry // Anal Bioanal Chem. 2004. V. 378. P. 883-897.
5. Иванникова Е.В., Жердев В.П., Бойко С.С., Исследование фармакокинетики и биодоступности в создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной структуры и их оптимальных лекарственных форм // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2013. №2. 17 с.
6. Liebler D.C., Zimmerman L.J. Targeted Quantitation of Proteins by Mass Spectrometry // Biochemistry. 2013. V. 52 (22). P. 3797-3806.
7. Gallien, S., Duriez, E., Crone, C et al. Targeted proteomic quantification on quadrupole-orbitrap mass spectrometer // Mol. Cell. Proteomics. 2012. V. 11. P. 1709-1723.
8. Tamvakopolos C. Mass spectrometry for the quantification of bioactive peptides in biological fluids // Mass Spectrometry Reviews. 2007. V. 26. P. 389- 402.
9. Ewles M, Goodwin L. Bioanalytical approaches to analyzing peptides and proteins by LC - MS/MS // Bioanalysis. 2011. V. 3. P. 1379-1397
10. Niwa M, Enomoto K, Yamashita K (1999) Measurement of the novel decapeptide cetrorelix in human plasma and urine by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr B 729:245-253
11. Bussy U., Wang H., Yu-Wen Chung-Davidson et al. Simultaneous determination of gonadotropin- inhibitory and gonadotropin-releasing hormones using ultra-high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry // Anal Bioanal Chem. 2015. V. 407. P. 497-507.
12. Anderson N. L., Anderson N. G., Haines L. R. et al. Mass Spectrometric Quantitation of Peptides and Proteins Using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) // Journal of Proteome Research. 2004. V. 3. P. 235-244.
13. Kenndler E. Introduction to chromatography. Vienna: Institute for Analytical Chemistry, 2004.
14. Schoneich, C., Kwok, S.K., Wilson, G.S. Separation and analysis of peptides and proteins // Anal. Chem. 1993. № 65. P. 67 - 84.
15. Bosch, E., Espinosa, S., Roses, M. Variation of pK values of acids and pH values of buffers in acetonitrile - water mobile phases // J. of Chromatogr. 1998. №. 824. P. 137-146.