Согласно принятой международной практике основным способом борьбы с инфекцией, вызываемой Haemophilus influenzae тип b (Hib-инфекцией), является вакцинопрофилактика [1]. Однако в РФ профилактика данной инфекции отечественными вакцинами практически не производится в связи с отсутствием полного цикла их производства. Поэтому актуальной задачей остается активизация разработки технологии производства вакцины против Hib- инфекции. Ранее сотрудниками СПбНИИВС из носоглотки больного ребенка был выделен штамм идентифицированный как Haemophilus influenzae тип b. Согласно приказу Минпромторга РФ от 14 июня 2013 г. № 916 при производстве вакцин создается система банков клеток, которая хранится при определенных условиях, обеспечивающих ее стабильность.
Цель исследования. Подобрать оптимальные условия хранения выделенного штамма H. influenzae тип b.
Материалы и методы. H. influenzae тип b культивировали в полусинтетической жидкой питательной среде и в сердечно-мозговом бульоне в колбах на шейкер-инкубаторе при температуре (35±2) °С и (150±10) об/мин на протяжении 6-8 ч до получения культуральной жидкости с оптической плотностью при длине волны 590 нм не менее 0,8. Полученную культуральную жидкость (109 КОЕ/мл) смешивали с криопротектором и разливали по криопробиркам. В качестве криопротектора использовали глицерин, обезжиренное молоко, сахарозу, лактозу, их добавляли в количестве 5-20 % (по объему). Как контроль использовали культуральную жидкость без криопротектора. Культуру хранили при температуре -(80±3) °С в низкотемпературном морозильнике на протяжении 1 года. Для подтверждения стабильности при выбранных условиях хранения через определенные промежутки времени проводили тест на жизнеспособность и выражали количество жизнеспособных клеток в процентах по отношению к начальной концентрации клеток (0 ч хранения).
Результаты и обсуждения. Показано, что жизнеспособность H. influenzae тип b зависела от питательной среды, используемой для культивирования, и была выше при выращивании штамма в полусинтетической питательной среде. Установлено, что исследуемые криопротекторы проявляли эффективность в различной степени в зависимости от их природы и концентрации. В табл. 1 представлены данные по жизнеспособности клеток в зависимости от используемого криопротектора в оптимальной концентрации.
Таблица 1 - Жизнеспособность клеток H. influenzae тип b в зависимости от природы
криопротектора
|
Криопротектор |
Концентрация криопротектора, % |
Количество жизнеспособных клеток (%) после хранения на протяжении (месяц) |
||||
|
1 |
3 |
6 |
8 |
12 |
||
|
Без криопротектора |
— |
87 |
65 |
42 |
30 |
15 |
|
Глицерин |
20 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
Обезжиренное молоко |
5 |
100 |
98 |
96 |
95 |
86 |
|
Сахароза |
10 |
100 |
86 |
64 |
51 |
45 |
|
Лактоза |
7 |
100 |
84 |
73 |
68 |
62 |
Показано, что максимальное количество жизнеспособных клеток (до 100 %) сохранялось в среде с 20 % глицерина на протяжении всего срока хранения. Добавление обезжиренного молока и углеводов приводило к снижению количества жизнеспособных клеток к концу эксперимента на 14-55 %. При хранении штамма в среде без криопротектора через 12 месяцев количество жизнеспособных клеток было минимальным и составляло всего 15 %.
Полученные результаты согласуются с описанными в литературе [2]. Так, выживаемость клее- ток штаммов H. influenzae тип b в среде при добавлении глицерина (отдельно или в смеси с другими криопротекторами) увеличивалась на 11-59 %. Различие в защитных свойствах криопротекторов можно объяснить механизмом их действия. Глицерин проникает через мембрану клетки и обеспечивает как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания, тогда как углеводы проявляют защитное действие только на наружной поверхности клеточной мембраны [3]. Значительное влияние на защитные свойства протектора оказывает состав питательной среды для выращивания штамма [3].
Выводы. Подобраны оптимальные условия хранения штамма H. influenzae тип b (полусин- тетическая питательная среда с 20 % глицерина), которые обеспечивают 100 % жизнеспособность клеток на протяжении 1 года.
Список литературы
- Zarei A.E., Almehdar H.A., Redwan E.M. Hib Vaccines: Past, Present, and Future Perspectives // J. Immunol. Res., 2016, doi: 10.1155/2016/7203587.
- Aulet de Saab O.C., de Castillo M.C., de Ruiz Holgado A.P., de Nader O.M. A comparative study of preservation and storage of Haemophilus influenzae. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 2001, V. 96, N 4, P. 583-586. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. // Cryobiology, 2003, V. 46, N 3, P. 205-229.