Тритикале является перспективным для выращивания в Украине как кормовой культуры, так как по показателям кормовой ценности превосходит пшеницу и кукурузу. Зерно этой культуры имеет перспективу и в сфере производства пищевых продуктов для человека. Тритикале бесспорно перспективно как биоэнергетическая культура для производства технического биоэтанола и качественного пищевого спирта для ликёро-водочных изделий [1]. Линии тритикале с измененным строением крахмала могут иметь дополнительные преимущества для производства продуктов пищевой и энергетической промышленности.
Колебание соотношения амилозы и амилопектина в крахмальных гранулах зерновых культур является важным показателем для определения сферы использования зерна. Главным ферментом биосинтеза амилозы является ассоциированная с гранулами синтеза крахмала форма - GBSSI (granule bound starch synthase I). В геноме мягкой пшеницы три гомеологических гена кодируют изоформы GBSSI фермента: Wx-A1, Wx-B1 и Wx-D1, которые расположены на плечах хромосом 7AS, 4AL и 7DS соответственно. В свою очередь, в геноме тритикале за синтез амилозы отвечают пшеничные гены Wx-A1, Wx-B1, расположенные в геноме А и ген, кодирующий фермент GBSSI от ржи в геноме R.
Каждый из генов Wx имеет несколько аллелей: аллель дикого типа (а), который кодирует синтез белка Wx, нуль-аллель (b), при котором блокируется синтез Wx протеина и функциональные аллели с разной ферментативной активностью белка GBSSI [2]. При создании линий тритикале с измененными свойствами крахмала ключевая роль отводится молекулярногенетическим методам определения переноса аллелей генов Wx-A1 и Wx-B1.
Целью работы была разработка и оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения аллельного состояния пшеничных генов вакси в геноме гексаплоидного тритикале и скрининг выборки гибридов для отбора линий, несущих нуль- аллели генов Wx-A1 и Wx-B1.
Материалы и методы: Материалом исследования служили 150 гибридов гексаплоидного тритикале F2, полученные в селекционных скрещиваниях.
Выделение общей растительной ДНК проводили из зеленого материала модифицированным ЦТАБ методом [3]. Реакционные смеси для проведения ПЦР включали: специфические праймеры по 0,25 мМ (Metabion, Германия), реакционного буфера B (Solis BioDyne, Эстония), 2 мМ раствора MgCl2 (Solis BioDyne), по 0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидов-3-фосфата (Fisher Thermo Scientific, США), 0,5 ед. полимеразы FIREPol® DNA Polymerase (Solis BioDyne), 30 нг очищенной суммарной растительной ДНК и деионизированную воду Milli-Q (Merck- Millipore, Германия) до конечного объема 20 мкл. Разделение продуктов амплификации проводили методом электрофореза в агарозном геле, литий боратном буфере с 0,5 мкг/мл бромистого этидия [4].
Результаты и обсуждения: ПЦР, разработанные и оптимизированные для детекции пшеничных генов вакси, были апробированы на линиях тритикале и показали высокую эффективность определения нуль-аллелей генов Wx-A1 и Wx-B1, а так же подтвердили возможность идентификации гетерозиготных организмов [5].
Скрининг выборки 150 F2 гибридов тритикале выявил:
- по гену Wx-A1: 49 образцов с аллелями дикого типа, 72 гетерозиготы и 28 образцов, с нуль- аллелем;
- по гену Wx-Bl: 56 образцов, несущих аллели дикого типа, 70 гетерозигот и 22 Wx образца по исследуемому гену, два образца неопределенно.
Среди исследуемой выборки образцов были обнаружены 3 желаемых генотипа Wx тритикале по пшеничным генам, которые были вовлечены в дальнейший селекционный процесс. Полученные гибриды показали неудовлетворительные агрономические свойства, поэтому были проведены дополнительные скрещивания для улучшения устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам.
Разработанная система ДНК-маркеров является эффективным инструментом отбора целевых генотипов на молекулярном уровне при получении зерновых с измененным составом крахмала. Таким образом, маркер-опосредованная селекция на основе ПЦР позволила отобрать перспективные образцы с желаемыми аллелями генов Wx-A1 и Wx-B1, которые будут использованы для получения продуктивных и устойчивых линий тритикале.
Список литературы
- Рибалка О.І., Моргун В.В., Моргун Б.В., Починок В.М. Агрономічний потенціал і перспективи тритикале // Физиология растений и генетика. - 2015. - Т.47. - № 2. - С. 95-111.
- Копусь М.М., Игнатьева Н.Г., Васюшкина Н.Е., Кравченко Н.С., Копусь Е.М. Генетический полиморфизм амилолитических ферментов зерна пшеницы и генетика ферментов биосинтеза крахмала // Зерновое хозяйство России. - 2009. - №4. - С. 23-27.
- Stewart C.N., Via L.E. A Rapid CTAB DNA Isolation Technique Useful for RAPD Fingerprinting and Other PCR Applications // BioTechniques. - 1993. - V. 14 (5). - Р. 748-749.
- Brody, J.R., Kern S.E. History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis // Anal. Biochem. - 2004. - V.333. - Р. 1-13.
- Степаненко О.В., Степаненко А.І., Моргун Б.В. Молекулярно-генетичні методи ідентифікаціі' алельних варіантів генів Wx у лініях м’яко! пшениці за допомогою кодомінантних молекулярних маркерів // Фактори експериментальноі еволюціі організмів. - К.: Логос, 2013. - Т. 12. - С. 309-313.