Полиморфизм днк, белков и некоторых ферментов солодки из различных популяций

В систематике растений, животных и микроорганизмов часто для установления генетических различий между близким группами организмов оказывется недастоточно имеющихся фенотопических и биохимических отличий. Требуются данные по структуре ДНК. Исходя из этого, для сравнительного изучения структуры ДНК солодки уральской из различных популяций нами был использован ПЦР- анализов (RAPD- амплификация). Анализ ДНК проводил с помощью 10 - членных праймеров. По резултатом анализа выявлено, что наиболее характерными являются праймеры названные ОРТ - 08, ОРТ-10 и ОРТ - 12. Остальные менее специфичны.

Материалы. Материалами для исследования послужили солодки из различных популяций.

Методы. Объектом исследования являлись солодка уральская (GlycyrrhizauralensisL.) и 8 растительных сообществ, образуемых ею. Кроме того, при сравнительных исследованиях брали солодку голую (GlycyrrhizaglabraL.), солодку вздутую (GlycyrrhizainflateL.), солодку ехинатовую (GlycyrrhizaechinatL.), солодку македонскую (GlycyrrhizamacedonicaL.), солодку бледно-цветковую (GlycyrrhizapallidifloraL.). Работа по изучению солодки проводилась в полевых лабораторных условиях. Содержание глицирризинновой кислоты в подземных органах солодки определяли по И. Муравьеву и В. Пономареву (1964) и спектрофотометрически по М. Якубовой и др. (1977).

Активность пероксидазы определяли по методу А.И.Бояркина (1951) и Х.Бергмайера (1974), белок по М.Bredford (1976). Электрофорез белков проводили в полиакриломидном геле в щелочной системе по методу B.Davis (1964), для эстеразы проявитель готовили по В.Яаске (1977).

Изоэлекторофокусирование проводили по прописи фирмы LKB с обязательным добавлением ТЕМЕД. Экстракцию, электрофоретическое разделение и определение активности амилазы проводили по методу О.Фурсова с соав.(1986). Электрофоретическое разделение полипептидов проводили по Леммли (Laemlietal.,1970).

ДНК выделяли с использованием камерческого набора фирмы Promega согласно по требованию набора.

Концентрацию ДНК определяли 0,7% агарозном геле. Более точное значение концентрации определяли с помощью спектрофотометрического метода.

RAPD - анализ проводили по DeOvidio (1990) в модификации А.Калиева (1998). Эндогенные фитогормоны определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа по М.Кудояровой (1990).

Амплификация и секвинирование гена rbcL как и HPLC - анализ листьев и корней проводились в ходе выполнения общих исследований в Университете г.Киото (Япония). Тотальная ДНК была экстрагирована из свежих листьев по MurrayandThompson (1980). Фрагмент 1374 п.н. ДНК, кодирующий большую последовательность гена rbcL, был амлифицирован в полимеразно-цепной реакции (PCR), для чего использовали тотальную ДНК, Taq - DNA - полимеразу. Реакции проводились со следующими праймерами (фирма OPEROH):

Орт 01 GGGCCACTCA 3004; 02 GGAGAGACTA 3068; 03 TCCACTCCTG 2930; 04

CACAGAGGGA3077; 05GGGTTTGGCA 3090; 06CAAGGGCAGA 3077; 07 GGCAGGCTGT 3075; 08 AACGGCGACA 3037; 09 CACCCCTGAG 2964; 10 CCNNCGGAAG 3019; 11 TTCCCCGCGA 2955; 12 GGGTGTGCCA 3130; 13 AGGACTGCCA 3028; 14 AATGCCGCAG 3028; 15 GGATGCCACT

Гль - электрофорез. Анализ резултатов RAPD-анализа проводить методом электрофореза в 0,7%, 1%, 1,2% агарозном гелях в трис-ацетатном буфере (0,8мМ трис-ацетат, 0,04мМ ЭДТА) и 4,5%

полиакриламидном геле в трис-боратном буфере (17,8 мМ трис-борат, 17,8мМ борная кислота, 0,4мМ ЭДТА), окрашивание в обоих случаях производили бромистым этидием (9,10).

Результаты исследования.

С помощью праймерма ОРТ - 8 амплифицированно 6 фрагментов. Для всех попцляций

характерны 5 зон, которые располагаются по величине молекулярной массыф от 200 до 1200 пар нуклеотидов (п.н.) При использовании ОРТ - 12 вявалено, что для изучаемых солодки характерен ряд уникальных продуктов. Для всех шести популяций характерны фрагменты длиной 1290 и 280 пар нуклеотидов, т.е. можно предположить, что они являются характерными и мономорфными для всех популяций и, впоследствии, эти продукты амплификации можно использовать в качестве молекулярногенетического маркера вышеуказанных популяций. На профиле ДНК солодки из сведово-солодковой и волоснецово-солодковой популяций ( праймер ОРТ - 10) отсутствует специфичный фрагмент длиной 320 пар нуклеотидов, что является характерным отличием этих популяций на уровне ДНК от остальных. Эти популяции полиморфны, как и ажерково-солодковая и содержание эндогенных гормонов у растений меняется.

Нами было установлено, что у растений, произрастающих в неблагоприятных условиях, содержание цитокининов и ИУК уменьшается, а АБК - увеличивается. Однако у разныз ассрциаций этот идет с различной интенсивностью: у солодковой в корнях содержаниек ИУК повышается, а АБК - низкое. В листьях содержание ИУК и цитокининов высокое, а АБК - низкое. В листьях содержание ИУК и цитокининов высокое, а АБК - низкое. У сведово-солодковой ассоциации в корнях по сравнению с листьями наблюдается значительно меньшее содержание ИУК и цитокининов, но большее АБК. Обычно при действии стрессора у растений содержание ИУК и цитокининов листьях не столь значительно, как в корнях и оно уменьшается при стресса, а АБК увеличивается. Это подтверждают данные по солодкам из солодковой и сведовой асоциаций. У солодкой из «благополучной» солодковой ассоциации АБК во всех вариантах меньше, чем в других ассоциациях, а цитокининов больше. Наоборот, а ИУК меньше. Таким образом, активность пероксидзы, содержание гормонов, хлорофиллов и каротиноидоа у солодки из различных популяций неодинаковы. Полученные данные свидетельствуют о специфичности метаболизма растений в различных ассоциациях.

Теги: Анализ
Год: 2015
Город: Шымкент
Категория: Медицина