Применение вэжх для идентификации гликлазида в химико- токсикологическом анализе

РЕЗЮМЕ

В представленной работе освещены результаты исследований по выбору условий ВЭЖХ для идентификации гликлазида в извлечениях, выделенных из биологических объектов. По результатам исследований максимальную площадь пика стандартного образца глик-лазида и площадь пика гликлазида, выделенного из биологического материала, наблюдали при 230 нм. При этом, время удерживания гликлазида, выделенного из тканей печени явля-ется сопоставимым с временем удерживания его стандартного образца. Полученные резуль-таты могут быть использованы для обнаружения данного токсиканта в биологических объектах при проведении судебно-токсикологических исследований.

Ключевые слова: гликлазид, изолирование, биологические объекты, идентификация, ВЭЖХ.

Введение: препараты производные сульфонилмочевины (глибенкламид, гликлазид, глипизид и глимепирид) составляют основу лечения сахарного диабета 2 типа. Среди них препарат второй генерации Гликлазид производится в большинстве стран мира под различ-ными торговыми названиями в виде монопрепарата (Глидиа МВ, Гликинорм, Гликлада, Гликлазид MR, Диабетон MR, Диаглизид MR), так и в комбинированных формах с метфор-мином (Глимекомб, Дианорм-М). Пожизненное применение, растущее число больных сахар-ным диабетом 2 типа, побочные действия, комбинированная терапия - факторы токсиколо-гической опасности неконтролируемого применения гликлазида. В соответствии с законодательными актами международной судебной практики при отравлении химическим веществом для определения токсиканта в биологических объектах проводятся судебно-токсикологические исследования.

Цель работы: выбор условий идентификации гликлазида в извлечениях из биологиче-ских объектов методом ВЭЖХ, приемлемых для целей химико-токсикологического анализа.

Материалы и методы: методика моделирования отравления. 50 г измельченной сви-ной печени помещают в колбу, добавляют 3 мл метанол-метиленхлоридного (1:1) раствора гликлазида, содержащего 20 мг вещества, перемешивают, выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре, добавляют 100 мл ацетонитрила, подкисленного HCl до рН=2 дваж-ды (2^100 мл) и фильтруют. В делительные воронки вносят ацетонитрильные экстракты, добавляют 2,5% водный раствор натрия сульфата, встряхивают в течение 5 мин и фильтру-ют. К полученному извлечению добавляют 10 мл н-гексана и встряхивают в течение 5 мин. Органический слой отделяют и не исследуют. К водному экстракту добавляют хлороформ (3x10 мл), органический слой отделяют. Полученные хлороформные экстракты хроматогра-фируют в условиях методов ТСХ и ВЭЖХ.

Исследования методом ТСХ. Исследования проводят на хроматографических пластин-ках Merck silica gel 60 F254 (производства Германии) размером 15x10 см. Перед элюировани-ем образцов хроматографические пластинки предварительно отмывают метанолом, активи-руют в сушильном шкафу при температуре 110-120 °С в течение 0,5 ч и делят на три части. На линию старта пластинки в виде точки в зону 1 наносят 10 мкл (1 мкг/мл) хлороформного раствора стандартного образца гликлазида, а в зоны 2 и 3 полосой шириной 2 см наносят ¼ часть хлороформного экстракта, полученного из тканей печени. После хроматографирования в этилацетате пластинку высушивают, а зону 1 и 2 обрабатывают специфическим для гликлазида проявителем: 1% раствором ванилина или 5% раствором хлоралгидрата. В необработанной проявителем зоне 3, в области, соответствующей значению Rf гликлазида, с пластинки скальпелем

снимают слой сорбента площадью 3^1 см, который помещают в стеклянный флакон, содержащий 10 мл метилового спирта. Встряхивают в течение 5 мин и фильтруют через фильтр «красная лента». Полученный элюат используют для ВЭЖХ исследований.

Исследования методом ВЭЖХ. Хроматографирование проводят на жидкостном хроматографе "Милихром-А-02" с УФ-детектированием (ЗАО «Эконова» Новосибирск, РФ). Для разделения веществ используют обратно-фазовую колонку Prontosil -120 - 5 - С18 - AQ раз-мером 02 х 75 мм, зернение 5 мкм («Bischoff Analysetechnik und Gerate GmbH», Германия). Градиентное элюирование выполняют путем смешивания двух элюентов: элюент А - [0.2М LiClO4 - 0.005M HClO4], элюент Б - ацетонитрил квалификации «для ВЭЖХ». Скорость под-вижной фазы - 100 мкл/мин. Температура термостата колонки - 35 □ С. УФ-спектрофотометрическое детектирование проводят одновременно при 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Анализ и обработку хроматограмм осуществляют с по-мощью программы «Аналитика-Chrom». Правильность методики периодически контроли-руют путем хроматографирования специального контрольного многокомпонентного раство-ра, состоящего из бромид-иона, уридина, кофеина, прозерина, м-нитроанилина, п-нитроанилина и трифтазина.

Результаты и их обсуждение: с целью моделирования отравлений гликлазидом измельченную свиную печень в течение суток выдерживали в хлороформ-метанольном (1:1) растворе его стандартного образца, взятого в токсических концентрациях. В соответствии с общепринятой методологией химико-токсикологического анализа (ХТА) при отравлении неизвестным веществом изолирование токсиканта из биологического объекта проводили общим для лекарственных веществ методом (ацетонитрилом, подкисленным хлористоводо-родной кислотой до рН=2) с очисткой извлечений от органических примесей н-гексаном. Полученный в результате изолирования хлороформный экстракт, был подвергнут дополни-тельной очистке в тонком слое сорбента. Так, при обработке первой и второй хроматографи-ческих зон специфическими проявителями: 1% раствором ванилина или 5% раствором хло-ралгидрата на хроматографической пластинке визуализировались индивидуальные пятна со значением Rf 0,470,48, соответствующие стандартному образцу. При этом, в первом случае пятно было окрашено в темно-синий цвет, а во втором- темно-коричневый. Полученный с третьей непроявленной реагентами хроматографической зоны метанольный элюат, был ис-следован методом ВЭЖХ. Присутствие вещества в элюате (рис. 1) идентифицировали по параметрам времени удерживания и спектральным характеристика путем сравнения с пара-метрами, заранее полученными для стандартного образца гликлазида (рис. 2). УФ-детектирование проводили одновременно при 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Для каждого пика рассчитывали 7 характерных нормированных спектральных параметров - отношение площадей пиков при длинах волн Х2 - Х8 к площади пика при длине волны Х1 210 нм (R=SX/S210).

По результатам исследований максимальную площадь пика стандартного образца гликлазида и площадь пика гликлазида, выделенного из биологического материала, наблю-дали при длине волны 230 нм. При этом, время удерживания гликлазида, выделенного из тканей печени (tR=7,85) является сопоставимым с временем удерживания его стандартного образца (tR=7,99).

Выводы: выбраны условия для идентификации гликлазида в извлечениях из биологи-ческих объектов методом ВЭЖХ. Полученные результаты могут быть использованы для об-наружения гликлазида в биологических объектах при проведении судебно-токсикологических исследований.

Год: 2015
Город: Шымкент
Категория: Медицина