Роль старения астроцитов в развитии болезни Альцгеймера

Аннотация

Объектом исследования явились астроциты головного мозга человека.

Цель работы: отработка методов определения активности в — галактозидазы ассоциированной со старением (SA—e—gal) и получение популяции стареющих астроцитов.

В результате проведенных работ получена популяция стареющих астроцитов. Результаты анализа динамики роста астроцитов показали, что до достижения репликативного старения или замедления клеточных делений, астроцитам потребовалось шестьдесят дней, где коэффициент удвоения популяций в культуре был равен 14,3. Количественный анализ содержания в клетках маркера старения SA—e—gal показал, что практически 100% клеток были окрашены позитивно.

Ключевые слова: старение, болезнь альцгеймера, астроциты, в — галактозидаза ассоциированная со старением (SA—e—gal).

Введение. Несмотря на то, что Болезнь Альцгеймера (БА) интенсивно изучается, основная причина развития данного заболевания до сих пор не известна. Однако, совершенно точно известно, что БА четко ассоциирована с возрастными изменениями. Старение является одним из основных факторов для многих заболеваний, тем не менее, возрастные механизмы, которые вовлечены в развитие БА изучены слабо. При рассмотрении процессов старения как факторов риска возрастных патологий, в частности БА, обнаруживается ряд феноменов, как на молекулярном, так и на клеточном уровне. Из них, особый интерес представляет клеточное старение. Этот процесс характеризуется необратимой остановкой клеточных делений и развивается в результате дисфункции теломер, повреждения ДНК, окислительного стресса и активации онкогенов [1]. Было замечено, что стареющие клетки накапливаются в тканях in vivo [2— 4]. Стареющие клетки секретируют цитокины и протеазы, которые наносят серьезные повреждения здоровым клеткам и могут инициировать возрастные нарушения в работе органа. Однако, роль стареющих клеток аккумулирующихся в тканях мозга и секретируемого ими комплекса нейротоксичных соединений и их функции до сих пор неясны.

Среди клеток центральной нервной системы (ЦНС) астроциты наиболее многочисленны и по количеству более чем в пять раз превосходят нейроны [5]. Они отвечают за регуляцию синаптических контактов, контролируют метаболизм ЦНС и поддерживают целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Таким образом, малейшая дисфункция астроглии может влиять на физиологию ЦНС в целом. Возрастные функциональные нарушения астроцитов были показаны как на in vivo так in vitro исследованиях [6]. Zhao и другие авторы (2011) показали, что в

ответ на окислительный стресс и истощение запаса клеточных делений астроциты человека переходят в состояние старения. Для стареющих астроцитов так же характерно повышенная концентрация секреторного фенотипа ассоциированных со старением (СФАС) [7]. СФАС фенотип стареющих астроцитов интересен тем, что некоторые его молекулы играют определённую роль в развитии БА. При изучении механизмов влияния СФАС астроцитов на БА первостепенной задачей является получение популяции стареющих клеток.

Методы и материалы.

В настоящей работе использовали культуру фетальных астроцитов головного мозга. Клетки культивировали в питательной среде DMEM (Life Technologies) содержащей 10% телячьей сыворотки (FBS, Life Technologies) с добавлением 1% пенициллин/стрептомицина (Sigma) и 1% глутамина (Sigma). Питательную среду меняли каждые 3-4 дня. Через различные промежутки времени, требуемого для удвоения популяции клеток, астроциты вновь пассажировали.

Старение астроцитов оценивали с помощью качественной реакции на активность фермента в-галактозидазы, который, как известно, является маркером стареющих клеток. Для этого астроциты культивировали в 6 луночных планшетах при температуре 37°С в течение 48 часов. Затем, клетки промывали в буферном растворе (PBS) и фиксировали в 0,5% глютаральдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре. После фиксации клетки окрашивали 5-бромо-4- хлоро-3-индоил-бета-D-галактопиранозидом и инкубировали в течение 12 часов при 37°С.

Обсуждение и выводы. Результаты проведенного исследования показали (Рис. 1), что через 50 дней культивирования и 14 удвоений популяции, плотность пассажа не менялась. Это свидетельствовало о снижении количества делений и репликативном старении популяции астроцитов.

Результаты оценки активности в-галактозидазы показали, что по сравнению с «молодыми» астроцитами процент положительно окрашенных клеток было намного выше в популяции претерпевшей 14 удвоений и 50 суток культивирования. Данные наблюдения соответствуют предыдущим и свидетельствуют в пользу того, что полученная культура клеток состояла из астроцитов со стареющим фенотипом.

Полученные астроциты в дальнейшем будут использованы для изучения роли стареющей астроглии мозга в амилоидогенезе и развитии БА.

Конфликт интересов: Работа выполнена в рамках Гранта Министерства образования и науки: «Изучение роли старения астроцитов в патогенезе болезни Альцгеймера и поиск потенциальных мишеней для терапии болезни Альцгеймера».

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Rodier F., Campisi J. Four faces of cellular senescence // J Cell Biol. -2011. -Vol. 192, № 4. - P. 547-556.
  2. Herbig U., Ferreira M., Condel L., Carey D., Sedivy J.M. Cellular senescence in aging primates // Science. -2006. -Vol. 311, № 5765. - P. 1257.
  3. Jeyapalan J.C., Sedivy J.M. Cellular senescence and organismal aging // Mech Ageing Dev. -2008. -Vol. 129, № 7-8. - P. 467-474.
  4. Michaloglou C., Vredeveld L.C., Soengas M.S., Denoyelle C., Kuilman T., van der Horst C.M., Majoor D.M., Shay J.W., Mooi W.J., Peeper D.S. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi // Nature. -2005. -Vol. 436, № 7051. - P. 720-724.
  5. Sofroniew M., Vinters H. Astrocytes: biology and pathology // Acta Neuropathol. -2010. -Vol. 119. - P. 7 - 35.
  6. Matsuoka Y., Picciano M., Malester B., LaFrancois J., Zehr C., Daeschner J., Olschowka J., Fonseca M., O'Banion M., Tenner A., Lemere C., Duff K. Inflammatory responses to amyloidosis in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease // Am J Pathol. -2001. -Vol. 158. - P. 1345 - 1354.
  7. Bhat R., Crowe E.P., Bitto A., Moh M., Katsetos C.D., Garcia F.U., Johnson F.B., Trojanowski J.Q., Sell C., Torres C. Astrocyte Senescence as a Component of Alzheimer’s Disease // PLoS ONE. - 2012. -Vol. 7, № 9. - P. e45069.
Год: 2015
Город: Шымкент
Категория: Медицина