Введение:
Аминогликозиды (АГ) представляют собой большое семейство водорастворимых поликатионных аминосахаров, которые используются как антибактериальные препараты широкого спектра действия. В дополнении к своей антимикробной эффективности АГ могут вызвать побочные токсические эффекты на почки и внутренне ухо.
АГ могут вызвать нарушения трансляции мРНК при взаимодействии с рибосомами во время синтеза белка. Один тип инициированого лекарственными препаратами ошибки трансляции является стоп-кодон. Поэтому благодаря измерению прочтений стоп кодонов в различных органах возможно проведение точного мониторинга локальной концентрации аминогликозидов.
Цель данного исследования является создание модели трансгенной мыши, экспрессирующей конструкцию «read-through», и изучение фармакокинетики и токсичности аминогликозидов с использованием этой модели.
Методы и материалы:
Используя стандартный метод клонирования ДНК было сконструировано несколько вариантов векторов, кодирующих связанные белки TurboGFP и TurboFP635, которые разделены стоп-кодоном, регулируемых промотером млекопитающих и сигналом полиаденилирования. В качестве стартового вектора использовались имеющиеся в продаже плазмиды pTurboGFP-C и pTurboFP635-C от компании Evrogen. Была сконструирована конструкция промотора Т7 для получения TurboGFP-СТОП-TurboFP635 мРНК in vitro. Конструкция TurboGFP-stop-TurboFP635 была экспрессирована в коммерческих, доступных in vitro системах трансляции бактерии E.coli. Мониторинг экспресии белков TurboGFP и TurboFP635 осуществлялся на основе «fluorescence imaging system» на базе лазерной детекции.
Результаты:
Создана плазмидная конструкция, состоящая из связанных кодирующих областей TurboGFP и FP635, разделенных стоп-кодоном. Результаты измерения продукции белков в in vitro системе E.coli в течение 30 минут показали рост уровня экспрессии TurboGFP белка при наличии АГ. Однако уровень экспрессии FP635 белка был низким, что может свидетельствовать о низкой чувствительности измерения индукции “read-through” эффекта путем экспрессии в in vitro системах.
Получены трансфицированные линии клеток HEK (временная трансфекция). Проведен мониторинг экспресии обоих белков TurboGFP и TurboFP635 в отсутствии генетицина и с генетицином (200 мкг/мкл, 500 мкг/мкл, 1000 мкг/мкл) и измерен эффект “read-through” как отношение TurboFP635:TurboGFP. Полученные результаты показали исправность работы конструкции, так как наблюдался небольшой рост эффекта “read- through”.
Выводы:
Впервые в Казахстане начато исследование для изучения биологических механизмов токсичности аминогликозидов на основе использования конструкции, состоящей из двух кодирующих регионов в одной рамке считывания и разделенных стоп-кодоном, экспрессирующие «read-through» уровень. Данное исследование позволит получить максимальные результаты путем изучения молекулярных механизмов токсичности аминогликозидов на живых трансгенных мышах в режиме реального времени без необходимости выведения животных из эксперимента (умерщвления).
Лучшее понимание механизмов фармакокинетики облегчит первые шаги к «персонализированному подходу» лечения пациентов в Казахстане. Полученные выводы могут быть использованы в дальнейшем для снижения побочных эффектов антибактериальных препаратов. Кроме того модель трансгенной мыши, экспрессирующая «read-through» эффект может быть использована для изучения фармакокинетики других групп лекарственных препаратов