Оценка эффективности методов выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани лабораторных грызунов

Аннотация

В статье приведена оценка эффективности методов выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани лабораторных грызунов.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, жировая ткань.

Введение :Терапия, основанная на применении стволовых клеток, является одним из перспективных клинических подходов для регенерации тканей [1; 2]. Стволовые клетки могут быть получены из нескольких источников: эмбрионов (эмбриональные стволовые клетки) и постнатальных организмов (стволовые клетки взрослого организма). Наиболее перспективными, с позиций применения для клеточной терапии, считаются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Они являются самообновляющейся популяцией клеток, которые могут быть выделены из различных тканей взрослого организма. МСК способны дифференцироваться в мезодермальные [3], эктодермальные [4] и энтодермальные клеточные линии [5]. Основным местом выделения МСК является костный мозг, тем не менее, у данного метода изоляции МСК есть несколько недостатков, которые связаны с клинической процедурой получения костного мозга, которая является весьма болезненной и инвазивной процедурой. Другим недостатком является небольшое количество клеток, которое можно получить при пункции костного мозга. Это приводит к более длительному времени культивирования для получения соответствующего количества клеток для использования в клинической практике [6].

Жировая ткань представляет большой потенциал в качестве источника МСК, так ее можно получать из "отходов" хирургических операций или при липосакции, которая считается безопасной хирургической процедурой [7]. Кроме того, МСК полученные из жировой ткани имеют большой потенциал дифференциации, и способны дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки и нервные клетки [8; 9]. Другим важным преимуществом жировой ткани в качестве источника клеток является большее количество МСК, которые находятся в этой ткани, по сравнению с костным мозгом [7].

Для эффективной изоляции МСК из жировой ткани важен выбор методики изоляции. Основным методом выделения МСК из жировой ткани является ферментативный метод, основанный на применении коллагеназы. Однако, в связи с рядом недостатком данного метода, таких как его дороговизна и негативным воздействием фермента на клетки, не прекращаются попытки усовершенствовать и упростить методы выделения клеток [10; 11].

В настоящей статье наряду с традиционным ферментативным методом рассматриваются два альтернативных метода, которые были недавно предложены в литературе. Целью данной работы была оценка эффективности данных методов выделения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани крыс.

Материалы и методы:

1. Ферментативный метод. У 12 месячных крыс извлекали эпидемиальную жировую ткань и периренальную жировую клетчатку, которые отмывали 3 раза в чашке Петри, содержащую PBS с 10% пенициллин/стрептомицина. Далее отмытые кусочки жира измельчали с помощью стерильных скальпелей и перемещали в 0.2% раствор коллагеназы IA типа (Sigma-Aldrich) в PBS и инкубировали при 37 градусах в водяной бане 1 час, с перемешиванием каждые 5 минут. Полученную суспензию затем фильтровали через 70pm фильтр и затем центрифугировали при 1250 rpm в течение 15 минут при температуре 20 градусов. Образовавшийся осадок из клеток аккуратно переносили в 75см² флакон для культивирования клеток и добавили 8 мл полной питательной среды DMEM. В течение 48 часов происходила адгезия клеток к поверхности флакона, далее заменяли среду. Клетки визуализировали под микроскопом и проверяли их состояние, а так же меняли среду каждый день, до формирования монослоя.
2. Эксплантный метод. У 12 месячных крыс извлекали эпидемиальную жировую ткань и периренальную жировую клетчатку и переносили в чашку Петри, содержащую питательную среду DMEM/F12 и 0.4% пен/стреп. Далее жировую ткань измельчали до фрагментов размером 3-4 мм. Полученные кусочки переносили в 6-и луночный планшет и добавили по 3мл первичной среды (DMEM/F12 содержащая 20% (v/v) ФБС и 0.2% (v/v) пен/стреп) в каждую лунку. Клетки визуализировали под микроскопом и проверяли их состояние, а так же меняли среду каждый день, до формирования монослоя [10].
3. Механический способ. У 12 месячных крыс извлекали эпидемиальную жировую ткань и периренальную жировую клетчатку и переносили в чашку Петри. Жировую ткань промывали три раза с помощью DMEM содержащую 2% пен/стреп и далее измельчали до очень маленьких фрагментов. Полученные фрагменты переносили в 50мл пробирку и добавляли erythrocyte lysis solution (1:1 объем). Полученную суспензию вортексировали 3 раза по 1-ой мин и инкубировали в водяной бане при 37 градусах в течение 15 мин. Далее суспензию центрифугировали при 900g в течении 15 минут. Далее образовавшийся осадок аккуратно переносили в 75см² флакон для культуры клеток и добавляли 8мл полной питательной среды DMEM. Клетки визуализировали под микроскопом и проверяли их состояние, а так же меняли среду каждый день, до формирования монослоя [11].

Иммунофлуоресцентный анализ

Для характеризации мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани крыс использовали метод иммунофлуоресценции. Проведен анализ клеток на наличие позитивных (CD90 и CD105) и негативных (CD34 и CD19) иммунофенотипических антигенов МСК.

Результаты

При выделении МСК из жировой ткани, с помощью ферментативного метода с использованием коллагеназы, в культуре обнаруживались клетки морфологически схожие с фибробластами на второй культуральный день. В конце 7-го дня культуры клеток МСК образовали монослой и достигали 80-90% конфлюэнтности. Результаты, полученные с использованием второго метода показали, что МСК мигрируют из эксплантов жировой ткани на 5-й культуральный день. Данные клетки имели фибробластноподобную морфологию. В сравнении с клетками, полученных с помощью первого метода, эти МСК были немногочисленны и имели меньше размерами. Использование механического разделения жировой ткани не привело к выделению МСК.

Иммунофлуоресцентный анализ показал, что выделенные клетки первого пассажа полученные ферментативным и эксплантным методом 100% экспрессируют поверхностные антигены, характерные для мезенхимальных, стволовых клеток: CD90 и CD105 (рисунок 1). На рисунке видна яркая цитоплазматическая окраска клеток и DAPI позитивные ядра.

На рисунке 2, представлены результаты окрашивания на негативные маркеры МСК: CD34 и CD19, которые характерны для гемопоэтических клеток. Клетки полученные из жировой ткани не экспрессировали данные блеки, поэтому на рисунке 2 можно видеть только клетки, окрашенные DAPI, без присутствия CD34 и CD19 позитивных клеток.

Таким образом, исследование методов изоляции мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани крыс, показало, что методика из двух альтернативных методов выделения МСК, только эксплантный метод приводил к выделению клеток, которые обладали характерной для МСК морфологией и экспрессировали характерные для МСК иммунофенотипические антигены.

Можно видеть, что использования коллагеназы намного эффективнее, так как выделяется большое количество МСК и монослой клеток при данном методе образуется быстрее. Однако во втором методе не используется коллагеназа, следовательно, это позволяет методу быть более экономически эффективным.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mason C., Brindley D.A., Culme-Seymour E.J., Davie N.L. Cell therapy industry: billion dollar global business with unlimited potential // Regen Med. -2011. -Vol. 6. - 3. - P. 265-72.
2. Korbling M., Estrov Z. Adult stem cells for tissue repair - a new therapeutic concept? // N Engl J Med. -2003. -Vol. 349. - 6. - P. 570-82.
3. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. -1999. -Vol. 284. - 5411. - P. 143-7.
4. Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains // Proc Natl Acad Sci U S A. -1999. -Vol. 96. - 19. - P. 10711-6.
5. Sato Y., Araki H., Kato J., Nakamura K., Kawano Y., Kobune M., Sato T., Miyanishi K., Takayama T., Takahashi M., Takimoto R., Iyama S., Matsunaga T., Ohtani S., Matsuura A., Hamada H., Niitsu Y. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion // Blood. -2005. -Vol. 106. - 2. - P. 756-63.
6. Strem B.M., Hicok K.C., Zhu M., Wulur I., Alfonso Z., Schreiber R.E., Fraser J.K., Hedrick M.H. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells // Keio J Med. -2005. -Vol. 54. - 3. - P. 132-41.
7. Fraser J.K., Wulur I., Alfonso Z., Hedrick M.H. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology // Trends Biotechnol. -2006. -Vol. 24. - 4. - P. 150-4.
8. Guilak F., Lott K.E., Awad H.A., Cao Q., Hicok K.C., Fermor B., Gimble J.M. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells // J Cell Physiol. -2006. -Vol. 206. - 1. - P. 229-37.
9. Qu C.Q., Zhang G.H., Zhang L.J., Yang G.S. Osteogenic and adipogenic potential of porcine adipose mesenchymal stem cells // In Vitro Cell Dev Biol Anim. -2007. -Vol. 43. - 2. - P. 95-100.
10. Mehmet Niyaz O.A.G., Serdar Gunaydin, Mehmet Ali Onur. Isolation, culturing and characterization of rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: a simple technique // Turk J Biol. - 2012. -Vol. 36. - P. 658-664
11. Baptista L.S., do Amaral R.J., Carias R.B., Aniceto M., Claudio-da-Silva C., Borojevic R. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples // Cytotherapy. -2009. -Vol. 11. - 6. - P. 706-15.