Перспективы применения полимер-белковых конъюгатов уриказы для лечения подагры

Аннотация

В статье рассматриваются вопросы терапии подагры лекарственными средствами. Особое внимание уделено применению препаратов на основе уриказы.

Ключевые слова: подагра, полимер-белковые конъюгаты, белково-полимерная инженерия .

Подагра представляет собой наиболее распространенную форму воспалительного артрита, которая может привести к снижению качества жизни и увеличению риска возникновения инфаркта миокарда, сердечного приступа и хронической почечной недостаточности [1].

Частота случаев заболевания подагрой увеличивается с возрастом и имеет гендерную обусловленность, так мужчины более подвержены заболеванию, чем женщины. Согласно эпидемиологическим исследованиям в последние несколько десятилетий частота заболеваний возросла в большей степени за счет увеличения факторов риска среди населения, таких как метаболический синдром, увеличение продолжительности жизни и белковое питание. Согласно статистическим данным частота заболеваемости подагрой выросла с 2.9 случаев на 1000 человек в 1990 году до 5.2 случая на 1000 человек в 1999 в США, с 2.6 случаев на 1000 человек в 1975 году 17 до 9.5 случая на 1000 человек в 1993 в Великобритании, с 3.6 случаев на 1000 человек в 2002 году до 5.3 случая на 1000 человек в 2004 году в Китае [2, 3].

В Казахстане также отмечается рост заболеваемости подагрой. Например, в ЮжноКазахстанском регионе количество случаев возросло с 18/100,000 в 1990 году до 60 в 2004. Важно отметить, что случаи инвалидности и госпитализации при заболевании подагрой также увеличились на 35% и 54% соответственно [4].

Основной причиной заболеванием подагры является нарушение метаболизма пуринов вследствие повышенной концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови (МКс), или гиперурекемии [5]. Когда уровень мочевой кислоты в крови превышает физиологическую норму (~360 цмоль/л) [6] начинается постепенный процесс отложения кристаллов моноуратов натрия (КМН) в области суставов и в конечном итоге это приводит к возникновению острых воспалительных процессов в суставах. Без должного лечения, отложения кристаллов урата не только приводят к дальнейшим воспалительным «атакам» (гиперемия), но и к необратимому повреждению суставов с хроническими симптомами и инвалидностью. Лечение острой воспалительной гиперемии заключается в применении нестероидных противовоспалительных препаратов, стероидов и колхицина. Однако после лечения также необходимы дальнейшие меры профилактики для постоянного снижения уровня мочевой кислоты в крови, предотвращения повторных случаев острой воспалительной гиперемией и развития хронического подагрирующего артирита.

В настоящее время в лечении подагры применяют два основных типа препаратов, снижающих уровень уратов в организме - ингибиторы ксантиноксидазы (ИКО), которые ингибируют выработку мочевой кислоты (аллопуринол и фебуксостат), и урикозурические препараты, цель которых увеличить скорость выведения мочевой кислоты в моче (пробенецид и бензбромарон). Урикозурические препараты ингибируют реабсорбцию анионов урата в эпителиальных клетках проксимальных почечных канальцев и, таким образом, усиливает секрецию уратов через почки. В свою очередь препараты ИКО ингибируют фермент ксантиноксидазу, которая катализирует реакцию превращения гипоксантина в ксантин, и далее ксантин в мочевую кислоту [7]. Все доступные на сегодняшний день методы лечения имеют свои недостатки, такие как увеличение частоты приступов артрита, острые аллергические реакции, почечная недостаточность и токсическое действие на печень.

Более того, ИКО и урикозурические препараты нацелены на предотвращение либо гипервыработки МК, либо ее недостаточное выведение из организма, в то время как причиной 8090% случаев гиперурикемии считается недостаточное выведение уратов, и только 10-20% приходится на гипервыработку. Таким образом, только с помощью комбинации обеих групп лекарственных средств можно достичь успешного лечения пациентов [8]. Поэтому поиск новых препаратов с меньшими побочными эффектами и более узким и специфичным действием продолжается.

С этой точки зрения одной из самых многообещающих мишеней при лечении подагры можно считать фермент уриказу, утерянный людьми и высшими приматами в ходе эволюции [9]. Уриказа участвует в конвертации урата в аллантоин, более растворимую субстанцию, что облегчает его выведение через выделительную систему. На протяжении нескольких десятилетий различные уриказы были протестированы для лечения гиперурикемии и только в 2010 году в США был лицензирован продукт пегилированной свиной уриказы (пеглотиказы) для лечения запущенных случаев подагры устойчивой к традиционному лечению (в 2013 году в Европе). Данный препарат необходимо вводить внутривенно (8мг каждые 2 недели), что ограничивает его использование в пределах стационара. Пеглотиказа чрезвычайно эффективна для резкого снижения уровня мочевой кислоты в крови на протяжении нескольких недель. Однако у нее есть следующие побочные эффекты: короткое время полужизни в крови, аллергические реакции и сильное раздражение кожного покрова на месте инъекции [10].

Таким образом, создание новых форм уриказы перорального введения с пониженной иммуногенностью и более длительным временем полужизни является важной задачей.

Последние достижения биохимии, белковой кристаллографии, химии, гликобиологии, молекулярной биологии и генетики способствовали пониманию структуры ферментов и их функций а также развитию технологий необходимых для создания новых ферментов с модифицированной функциональной активностью.

Развивающаяся отрасль белковой инженерии, которую называют белково-полимерной инженерией, заключается в присоединении хорошо изученных синтетических полимеров к белкам с целью модификации их функций, стабильности, транспортных свойств или иммуногенности.

Иммобилизации ферментов используется для манипулирования природными свойствами белков, особенно в части, касающейся оптимизации производственных процессов. Иммобилизация традиционно включает в себя прямое присоединение ферментов к твердым поверхностям путем прямого присоединения, инкорпорация в полимерный матрикс с помощью ковалентных связей и захват [11].

Впервые ферменты присоединялись к полимерному матриксу с помощью ковалентных связей, где были использованы многоточечные присоединения ферментов и антител к полиуретановой пленке [12-14].

Эти иммобилизированные ферменты на пленке сохраняли высокий уровень каталитической и антиген связывающей активности. Полимерная модификация фермента в нескольких местах позволяла сохранить его функциональную активность. Это наблюдение легло в основу современной концепции БПИ, как развитие подхода иммобилизации фермента, где растворимые биологические коньюгаты наноматериалов были синтезированы путем прямой модификации протеинов с множественными полимерными цепочками [15-17]. С помощью присоединения к белкам полимеров можно изменить стабильность и активность белковой структуры, и таким образом менять, или добавлять новые функции в различных микросредах. Одна из самых активных областей исследования - это ковалентное соединение терапевтических белков с полимерами, использование которых было одобрено Комиссией по контролю за лекарствами и питательными веществами для применения в клинике [18]. Например, коньюгация полиэтилен гликоля (ПЭГ) с интерфероном (PEGINTRON) и рекомбинантным рецептором фактора некроза опухоли TNF (Enbrel).

В настоящее время для создания полимер-белковых коньюгатов используется полиэтилен гликоль, что и привело к росту многомиллионной индустрии. Белки, ферменты, белки клеточной поверхности и малые молекулы были пегилированы для увеличения стабильности белка и увеличению времени полужизни в крови. Однако, процесс пегилирования является слабо контролируемым и зачастую реакция не приводит к предполагаемому (ожидаемому) эффекту, поэтому значительный интерес представляет собой использование различных полимеров и коньюгационных технологий для синтеза новых биоконьюгатов с возможностью контроля их структуры [19, 20]. Одно из главных ограничений пегилирования - это невозможность их использования для перорального применения.

Данные проблемы связанные с побочным действием пеглотиказы, снижают ее терапевтическую значимость и требуют создания более эффективных препаратов. В 2015 году в лаборатории биоинженерии и регенеративной медицины, Национальная лаборатория Астана, Назарбаев Университет были начаты исследования в рамках гранта МОН РК «Разработка полимер-протеи- новой транспортной системы перорального применения для терапии подагры», которые проводятся с Университетом Карнеги Меллона (США). В настоящее время нашей группой совместно с лабораторией доктора Алана Рассела были синтезированы полимер-белковые конъюгаты уриказы. Полимерная часть данного комплекса была получена полимеризацией олиго (этиленгликол) метакрилат метилового эфира (pOEGMA) с метода atom-transfer radical polymerization (ATRP). Мы ожидаем, что дальнейшие исследования свойств уже синтезированных и тех, что будут синтезированных комплексов, позволит разработать новый эффективный препарат для лечения подагры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Seminog O.O., Goldacre M.J. Gout as a risk factor for myocardial infarction and stroke in England: evidence from record linkage studies // Rheumatology (Oxford). -2013. -Vol. 52, № 12. - P. 2251-2259.
2. Roddy E., Choi H.K. Epidemiology of gout // Rheum Dis Clin North Am. -2014. -Vol. 40, № 2. - P. 155-175.
3. Roddy E., Doherty M. Epidemiology of gout // Arthritis Res Ther. -2010. -Vol. 12, № 6. - P. 223.
4. Karkambayeva A.D., Toiymbetova M.A. Trends in Gout Morbidity in South Kazakhstan region // Nauchno-prakticheskaya revmatologiya. -2006. № 2. - P. 86.
5. Richette P., Bardin T. Gout // The Lancet. -2010. -Vol. 375, № 9711. - P. 318-328.
6. Rees F., Hui M., Doherty M. Optimizing current treatment of gout // Nat Rev Rheumatol. -2014. - Vol. 10, № 5. - P. 271-283.
7. Terkeltaub R. Gout. Novel therapies for treatment of gout and hyperuricemia // Arthritis Res Ther. -2009. -Vol. 11, № 4. - P. 236.
8. B-Rao C., Kulkarni-Almeida A., Katkar K.V., Khanna S., Ghosh U., Keche A., Shah P., Srivastava A., Korde V., Nemmani K.V.S., Deshmukh N.J., Dixit A., Brahma M.K., Bahirat U., Doshi L., Sharma R., Sivaramakrishnan H. Identification of novel isocytosine derivatives as xanthine oxidase inhibitors from a set of virtual screening hits // Bioorganic & Medicinal Chemistry. -2012. -Vol. 20, № 9. - P. 2930-2939.
9. Wu X.W., Lee C.C., Muzny D.M., Caskey C.T. Urate oxidase: primary structure and evolutionary implications // Proc Natl Acad Sci U S A. -1989. -Vol. 86, № 23. - P. 9412-9416.
10. Cavagna L., Taylor W.J. The emerging role of biotechnological drugs in the treatment of gout // Biomed Res Int. -2014. -Vol. 2014. - P. 264859.
11. Sheldon R.A. Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance // Adv. Synth. Catal. -2007. № 349. - P. 1289 - 1307.
12. Drevon G.F., Russell A.J. Irreversible immobilization of diisopropylfluorophosphatase in polyurethane polymers // Biomacromolecules. -2000. -Vol. 1, № 4. - P. 571-576.
13. Drevon G.F., Danielmeier K., Federspiel W., Stolz D.B., Wicks D.A., Yu P.C., Russell A.J. High-activity enzyme-polyurethane coatings // Biotechnol Bioeng. -2002. -Vol. 79, № 7. - P. 785-794.
14. Koepsel R.R., Russell A.J. Directed capture of enzymes and bacteria on bioplastic films // Biomacromolecules. -2003. -Vol. 4, № 3. - P. 850-855.
15. Murata H., Cummings C.S., Koepsel R.R., Russell A.J. Polymer-based protein engineering can rationally tune enzyme activity, pH-dependence, and stability // Biomacromolecules. -2013. -Vol. 14, № 6. - P. 1919-1926.
16. Cummings C., Murata H., Koepsel R., Russell A.J. Tailoring enzyme activity and stability using polymer-based protein engineering // Biomaterials. -2013. -Vol. 34, № 30. - P. 7437-7443.
17. Cummings C., Murata H., Koepsel R., Russell A.J. Dramatically increased pH and temperature stability of chymotrypsin using dual block polymer-based protein engineering // Biomacromolecules. - 2014. -Vol. 15, № 3. - P. 763-771.
18. Alconcel S.N.S., Baas A.S., Maynard H.D. FDA-approved poly(ethylene glycol)-protein conjugate drugs // Polym Chem. -2011. № 2. - P. 1442-1448.
19. Kalia J., Raines R.T. Advances in Bioconjugation // Curr Org Chem. -2010. -Vol. 14, № 2. - P. 138-147.
20. Stephanopoulos N., Francis M.B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy // Nat Chem Biol. -2011. -Vol. 7, № 12. - P. 876-884.