К вопросу этиологической диагностики туберкулеза

АННОТАЦИЯ

Данная статья посвящена современным возможностям этиологической диагностики туберкулеза, направленных на подтверждения наличия возбудителя в диагностическом материале и его характеристику, как видовую принадлежность и спектр лекарственной чувствительности необходимых для своевременной диагностики и лечения туберкулеза.

Ключевые слова: туберкулез, лабораторная диагностика, микобактерия туберкулеза.

Этиологическая диагностика туберкулеза должна основываться на действующей нормативной базе, регламентирующей ее деятельность, и направлена на обеспечение доступности обследования для всего населения вне зависимости от географических особенностей мест проживания или социального статуса пациента; быстрой диагностики заболевания и определения лекарственной чувствительности возбудителя; использования методов исследования с доказанной эффективностью с целью наиболее полного удовлетворения требований к качеству диагностики и контроля лечения больных туберкулезом, эффективного мониторинга распространения лекарственно устойчивых форм туберкулеза; высокого качества, экономической эффективности и безопасности лабораторных исследований; устойчивой системы развития этиологической диагностики туберкулеза, в том числе быстрого внедрения и эффективного использования инновационных подходов.

Обнаружение наиболее опасных источников туберкулезной инфекции среди пациентов, обратившихся в лечебные учреждения, а именно больных ТБ легких, в мокроте которых микобактерии определяются методом простой бактериоскопии, является главным компонентом борьбы с туберкулезом. Цель состоит в установлении источника инфекции в обществе, каким является человек, выделяющий большое количество туберкулезных микобактерий. Лечение таких пациентов быстро делает их безопасными для окружающих, благодаря чему разрывается цепочка передачи инфекции. Еще одним преимуществом выявления случаев заболевания становится сокращение времени до начала эффективного лечения, при котором возрастает вероятность излечения.

Основное внимание должно быть обращено на взрослых, обратившихся в лечебные учреждения с жалобами на длительно сохраняющийся кашель. Именно среди них следует проводить скрининг методом бактериоскопического исследования мазков мокроты. Этот метод позволяет с меньшими затратами и более точно, чем метод флюорографии, идентифицировать больных, являющихся распространителями туберкулеза. Бактериоскопия мокроты имеет ряд непосредственных преимуществ по сравнению с посевом. Таким преимуществом является значительно более быстрое получение результатов исследования, которые отражают степень инфекционной опасности больного.

Кроме того, эти результаты позволяют судить как о вероятности летального исхода от туберкулеза, если не будет проведено необходимое лечение, так и о необходимости более интенсивной лекарственной терапии на начальном этапе в связи с особенно высокой бактериальной нагрузкой. Исследование мазков мокроты играет весьма незначительную роль в систематическом выявлении туберкулеза у длительно кашляющих взрослых в странах с очень низкой распространенностью этого заболевания в связи с низкой экономической эффективностью и высоким риском ложноположительных результатов.

Выявление случаев заболевания с помощью бактериоскопии мазков мокроты у амбулаторных пациентов способно существенно повысить число выявленных источников инфекции. Показателями активности работы по выявлению случаев заболевания служат количество обследованных амбулаторных пациентов, число проведенных бактериоскопий и число обнаруженных источников заражения.

Вместе с этим, микроскопия мазков мокроты играет ключевую роль в мониторинге ответов на химиотерапию больных туберкулезом легких, выделяющих микобактерии. Это исследование следует повторять в конце первого этапа химиотерапии. Если возбудители продолжают обнаруживаться, то сроки интенсивной фазы терапии удлиняются еще на 1 мес. Бактериоскопию мазков следует проводить также во время второго поддерживающего этапа химиотерапии и в конце его, что позволяет судить об излечении туберкулеза. Абациллирование мокроты (конверсия), наступающее на 2-3 месяце химиотерапии, считается хорошим прогностическим показателем. Он определяется по соотношению между числом больных бактериовыделителей в начале лечения, у которых не выявляются КУМ методом бактериоскопии к концу курса химиотерапии, и общим числом больных, начавших лечение.

Этот показатель говорит о возможностях программы удерживать больных на лечении, сбору образцов мокроты, устранению источников инфекции, а также является ранним показателем исхода лечения. Короткие курсы химиотерапии могут быть вполне эффективными у больных, в мазках мокроты которых после 2-3 мес лечения продолжают обнаруживаться кислотоустойчивые микобактерии, не растущие на питательных средах (видимые, но не растущие). В подобных ситуациях имеет место выделение уже мертвых бактерий. Поэтому заключение о неэффективности химиотерапии у больных с продолжающимся бактериовыделением следует давать не ранее чем через 5 мес и более после начала лечения. Исчезновение микобактерий из мазков мокроты в процессе химиотерапии и их отсутствие в конце лечения позволяет считать такого пациента излеченным от туберкулеза. Иногда больному не разъясняют, что представляет собой мокрота и как правильно следует ее собирать. Нужно обязательно рассказать больному, что слюна и отделяемое из носоглотки непригодны для бактериоскопии. Больных следует подбадривать и предоставлять им достаточно времени, чтобы они могли собрать бронхиальную мокроту «из глубины грудной клетки». Им надо предложить сделать несколько глубоких вдохов и откашляться как можно глубже.

Наряду с этим, культуральные методы исследования или методы посева основываются на выращивание микобактерий, содержащихся в патологическом материале, на искусственных средах. С точки зрения бактериолога, можно выделить две главные категории больных. Одна из них - это наиболее опасные в эпидемиологическом плане больные, выделяющие большое количество микобактерий, присутствующих почти в каждой порции мокроты и легко выявляющихся при бактериоскопии ее мазков. Другая, менее опасная, группа больных, выделяющих небольшое количество микобактерий, обнаруживаемых преимущественно методом посева. Больные последней группы могут выделять микобактерии только время от времени.

До тех пор пока туберкулез будет широко распространенным заболеванием, культуральный метод исследования останется второстепенным, а основная роль в его диагностике будет принадлежит бактериоскопии мазков и методам клинико-рентгенологического обследования больных. Посевы должны проводиться при диагностике внелегочного туберкулеза, если имеется возможность получения диагностического материала (например, при туберкулезе периферических лимфатических узлов). Проведение посевов особенно показано у ВИЧ инфицированных пациентов, так как это позволяет существенно сократить число ошибок при диагностике и лечении патологии у них. Посевы также необходимы для определения спектра лекарственной чувствительности возбудителя и контроля за развитием устойчивости к противотуберкулезным препаратам.

Выявления возбудителя туберкулеза в диагностическом материале необходим для лечения туберкулеза. Все методы диагностики заболеваний можно разделить на прямые, позволяющие выявить непосредственно этиологический агент заболевания и косвенные, которые выявляют последствия воздействия этиологического агента на организм методам традиционные методы микробиологической диагностики (микроскопия и посев) и ПЦР - диагностика, позволяющая определять наличие ДНК возбудителя в диагностическом материале.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) -молекулярно-генетический метод, позволяющий добиться значительного увеличения (амплификации) малых концентраций определённых (специфичных) фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) возбудителя в биологическом материале (пробе) и подтвердить наличие этиологического агента в материале даже при его незначительном количестве. В результате последовательных циклов удвоения специфического фрагмента ДНК возбудителя число копий возрастает экспоненциально, и всего за несколько часов можно получить более 100 млрд. копий. Недостатком метода является то, что обнаружение ДНК не позволяет во всех случаях говорить о наличии живых клеток возбудителя. Поэтому этот метод не рекомендуется для контроля эффективности противотуберкулезной химиотерапии. На начальных этапах развития ПЦР диагностических систем детекция амплифицированного продукта реакции была связана с этапом электрофореза. Большие количества копий амплифицированной ДНК создавали угрозу перекрестной контаминации образцов в процессе их внесения в гель и загрязнения самой лаборатории. Этим обуславливались жесткие требования к разграничению зон проведения разных этапов теста.

Современные ПЦР-технологии - ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) позволяют регистрировать количество специфичного фрагмента ДНК параллельно с его амплификацией. Эта технология позволяет не только выявить ДНК возбудителя в образце, но определить его количество в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для этого используют флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК (интеркаляция возможна в случае, если краситель имеет подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК) или модифицированные дезоксирибонуклеотиды, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Дополнительным преимуществом ПЦР-РВ является отсутствие стадии электрофореза в процедуре исследования, что позволяет минимизировать риск контаминации образцов и лаборатории продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Это снижает требования к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Примером автоматизированной системы ПЦР-РВ является катриджная технология Gene-XPert, рекомендованная Всемирной организацией здравоохранения для лабораторной диагностики туберкулеза. Эта система позволяет одновременно выявлять ДНК возбудителя в диагностическом материале и подтверждать/исключать наличие мутаций в rpoB гене, приводящих к устойчивости бактерий к рифампицину.

Данные клинических испытаний ПЦР-РТ известны только для Gene-XPert. По результатам метаанализа диагностическая чувствительность этой тест-системы для диагностики туберкулеза легких составляет 88% (84% -92%), специфичность - 99% - в сравнении с результатами посева на плотные и жидкие среды. Средняя чувствительность для образцов с положительным результатом микроскопии составила 88% (84-92), для образцов с отрицательным результатом микроскопии - 68% (61-74). Данные о клинических испытаниях отечественных тест-систем для диагностики туберкулеза легких найти не удалось.

Данные клинических испытаний Gene-XPert для выявления возбудителя во внелегочных материалах дают среднюю чувствительность, варьирующую от 43,7% для плевральной жидкости до 84,9% - для лимфоузлов (данные мета-анализа,). Применение отечественной ПЦР-РВ тест-системы позволило выявить микобактерии туберкулезного комплекса в 14,6% из 80 больных ВИЧ с симптомами сепсиса, тогда как наиболее эффективные методы посева - в 6,9% образцов. Значительным преимуществом всех методов ПЦР- РВ является малое время оборота теста. Для Gene-XPert это время составляет два часа, время выдачи результата определяется мощностью прибора. Для отечественных тест-систем это время также составляет 4 - 4,5 часа. Среднее время выдачи результата не должно превышать одного рабочего дня.

Таким образом, по результатам анализа многочисленных публикаций, ПЦР-РТ (на примере GeneXPert) имеет значительно большую чувствительность, чем метод микроскопии, имея сравнимую с ней диагностическую специфичность. Он несколько уступает в чувствительности методу посева, но позволяет получить результат в течение одного рабочего дня. Gene-XPert позволяет с большой вероятностью подтвердить наличие у больного МЛУ туберкулеза.

Культуральные методы исследования или методы посева основываются на выращивание микобактерий, содержащихся в диагностическом материале, на искусственных средах. В случае микобактерий туберкулеза эти методы применяются начиная с первой половины двадцатого века. Микобактерии туберкулезного комплекса характеризуются длительным временем культивирования (до двух и более месяцев), специфическим требованиям к питательным свойствам питательной среды. Длительное время выращивания микобактерий туберкулезного комплекса повышает частоту загрязнения засеянных сред быстрорастущей немикобактериальной флорой. В связи с этим, перед посевом диагностический материал подвергается дополнительной процедуре - деконтаминации. В результате этой обработки убивается большая часть нетуберкулезной флоры, однако при этом гибнет и часть клеток МБТ. Качество проведения этой процедуры существенно влияет на эффективность посева.

Наиболее распространенным средами для выделения МБТК являются среды на основе куриных яиц - среда Левенштейна-Йенсена и более кислые среды Огавы и ФИНН II. Эти среды дешевы, содержат в своем составе малахитовый зеленый, угнетающий рост немикобактериальной флоры. Главным недостатком этих сред является низкая скорость роста туберкулезных микобактерий - до 8 - 10 недель роста, а также относительно меньшая их пригодность для выделения нетуберкулезных микобактерий.

Жидкие среды, и, особенно, среда Миддлбрук 7Н9 позволяют уменьшить сроки культивирования микобактерий (среднее время появления роста - 10-14 дней, увеличивают выход туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий [17]. Это связано и с более щадящим методом деконтаминации, применяющимся при подготовке образцов для посева в эти среды. Однако использование этих сред приводит к сравнительно большей доле проростов и предъявляет более высокие требования к системе биобезопасности в лаборатории и квалификации персонала. Кроме того, эти среды имеют большую стоимость, по сравнению с плотными средами.

Жидкие среды применяются в микробиологических автоматических анализаторах. Анализаторы, позволяющие значительно снизить время определения наличия роста микроорганизмов - анализаторы с флуоресцентной детекцией роста. Применение стандартизованных, промышленно изготовленных реагентов и расходных материалов, а также стандартизация условий культивирования и регистрации результатов позволяют снизить вероятность ошибки лабораторного специалиста и повышают культуру труда в бактериологической лаборатории, повышая, в конечно счете эффективность и достоверность исследования. Плотные и жидкие среды могут применяться для исследования любых диагностических материалов, включая бронхо-легочный материал (мокроту,промывные воды бронхов, аспирационный материал, БАЛ, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др), биопсийные и операционные материалы (лимфатических узлов, паренхиматозных органов, гной, грануляции, секвестры, фрагменты межпозвоночных дисков и костей кожи, костей), моча, кровь и другие. Наибольшая эффективность метода посева достигается при применении нескольких сред, одна из которых - жидкая.

Эффективность применения различных комплектов сред с учетом времени получения результатов различна для различных материалов. Для бронхолегочных материалов оптимальным является применение среды Левенштейна-Йенсена и среды Миддлбрук 7Н9 с флуоресцентной детекцией роста, для большинства внелегочных материалов - плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и ФИНН II и среды Миддлбрук 7Н9 с применением детекцией роста. Разработаны и селективные жидкие среды для выделения туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий из крови. Применение этих методов имеет большое значение, особенно для диагностики этиологии бактериемии у ВИЧ-инфицированных больных. Для посевов мочи в настоящее время рекомендуется только посев на две плотные яичные среды.

Этиологические исследования методом посева требуют дорогостоящего оснащения лаборатории и высокой квалификации ее сотрудников. Стоимость внедрение метода посева в жидкие среды, и особенно автоматических микробиологических анализаторов, также как и стоимость самого исследования, высока. Стоимость посева на яичные среды значительно ниже. Несмотря на это, большая эффективность исследований с использованием жидких сред и флуоресценной детекцией роста значительное сокращение времени получения результата для большинства бронхо-легочных образцов, обеспечивает стандартизацию процесса и минимизацию влияния на результат «человеческого фактора», повышает достоверность полученных результатов. Все это делает посев в жидкие среды с флуоресцентной детекцией приоритетной технологией исследования для этиологического подтверждения диагноза «Туберкулез».

Несмотря на значительно большие сроки получения результатов методом посева по сравнению с методами ПЦР, на сегодняшний день методы посева имеют большую чувствительность. Кроме того, при посеве диагностического материала удается выделить и культуры нетуберкулезных микобактерий в случае микобактериозов, что не позволяют сделать основанные на выявлении специфичных для микобактерий туберкулезного комплекса фрагментов ДНК ПЦР-методы. Кроме того, культура микобактерий, полученная при посеве диагностического материала, необходима для проведения дальнейшего изучения спектра лекарственной чувствительности микроорганизмов.

Таким образом, обнаружение микобактерий имеет решающее значение не только для диагностики туберкулеза, оно чрезвычайно важно при прогнозировании течения процесса, выборе рациональной схемы лечения и правильной оценке его эффективности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Комплексный план по борьбе с туберкулезом в Республике Казахстан на 2014-2020 годы. - Постановление Правительства РК от 24.09.2013.
2. Старшинова А.А., Павлова М.В., Довгалюк И.Ф., Журавлев В.Ю.. Иммунологические и молекулярногенетические методы диагностики туберкулеза. - Инновационные технологии во фтизиатрии и пульмонологии. - Научная сессия ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии, 5.04.2013г. - СПб.: 2013. - Доклад-презентация.- 26 с.
3. Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А . Использование теста “QuantiFERON-TB Gold In-Tube” в диагностике туберкулеза легких/ Материалы Х съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - “Инфекция и иммунитет”. - 2012. - № 1-2. - С. 20 - 21. 4.18-й Доклад о глобальной борьбе с туберкулезом. - ВОЗ, 2013.
4. Кодекс республики Казахстан «О здоровье народа и системе здравоохранения». - 18.09.2009. - №193-IV
5. Государственная программа «Саламатты Қазақстан» на 2011 - 2015 годы. - Утв.Указом Президента Республики Казахстан от 29 ноября 2010 года № 1113.
6. Санитарные правила «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий по предупреждению инфекционных заболеваний». - Утверждены постановлением Правительства РК от 12.01. 2012 года № 33
7. О некоторых вопросах по борьбе с туберкулезом. - Приказ Министра здравоохранения Республики Казахстан № 218 25 апреля 2011 года
8. О мерах совершенствования мероприятий по борьбе с туберкулезом в Республике Казахстан. - Приказ МЗ РК № 404 от 17 июня 2011 г.
9. О внесении изменений и дополнений в постановление Правительства Республики Казахстан от 12 января 2012 года № 33 “Об утверждении Санитарных правил “Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий по предупреждению инфекционных заболеваний”.- Постановление Правительства Республики Казахстан от 19.06.13г., № 627
10. О внедрении пилотного проекта по расширенному стационарозамещающему лечению больных туберкулезом. - Приказ Министра здравоохранения Республики Казахстан от 12.07.13г № 402.
11. Отчет за 2012 год по выполнению плана “первоочередные меры по борьбе с туберкулезом в Республике Казахстан.- Отчет НП ЦССЭиМ КГСЭН. - 21.02.2013г.
12. Здоровье населения республики Казахстан и деятельность организаций здравоохранения в 2012 году./ Статистический сборник. - Астана: 2013.
13. Harada N. Characteristics of a diagnostic method for tuberculosis infection based on whole blood interferon-gamma assay. Kekkaku. - 2006. - 81. - 11. - P. 681-686.
14. Русакова Л.И. Выявление и диагностика туберкулеза на современном этапе.- Москва:, Центральный НИИ Туберкулеза РАМН. - 2012. - 30с.
15. Ismail N.A., Baba K., Pombo D., Hoosen A.A. Use of an immunochromatographic kit for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis from broth cultures.- Int. J. Tuberc. Lung Dis, 2009. - 13. - 8. - P. 1045-1047.
16. Требования к стандартам организации по неразрезанному листу для экспресс-теста TB на определение туберкулеза. - Bio Focus Co., Ltd
17. Быстрое внедрение диагностического теста Xpert MTB/RIF. Технические и операционные рекомендации; Вопросы практического применения.- ©ВОЗ,2011.
18. Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И.. Серологическая диагностика туберкулеза: новая тест-система для серодиагностики туберкулёза. - http://il.ks.ua/index.html
19. Черноусова Л.Н. Современные технологии для микробиологической диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза.- Презентация TB CARE проекта II. - М.:ФГБУ Центральный НИИ туберкулеза РАМН,2013. - 48с.
20. А.М. Толемисова, Р.М. Балмахаева. Об инновациях в лабораторной диагностике туберкулеза в республике казахстан. Обзор литературы. Материалы межд. научно-практ. конф. «Инновационные технологии диагностики МЛУ ТБ», Алматы, 2014г.