Совершенствование методик химико-токсикологического анализа бисопролола

АННОТАЦИЯ

В статье представлена методика определения бисопролола в биологической жидкости с использованием ТСХ-УФ-спектрофотометрии. Экспериментально подобраны условия хроматографирования. Бисопролол имеет оптимальные значение Rf в пределах 0,5 в экспериментально подобранной в подвижной фазе, состоящей из хлороформа-спирта изопропилового-этилацетата-раствора аммония гидроксида конц. в соотношениях 40:9,5:0,5 (по объему). Количественное определение бисопролола методом УФ-спектрофотометрии проводили после элюирования хроматографической пластины при длине волны 278 нм. Предложенная методика позволяет определить 65,5±2,19 мкг/мл бисопролола, что составляет 81,88 % при относительном стандартном отклонении RSD 3,18 %.

Ключевые слова: бисопролол, ТСХ-УФ-спектрофотометрия, биологические объекты, система растворителей, гипотензивные лекарственные средства, острые отравления.

В последнее время подходы к лечению сердечно-сосудистых заболеваний значительно изменились. Существенное значение придаётся лечебно-профилактическому длительному приёму эффективных и сравнительно безопасных сердечно-сосудистых препаратов, к которым относятся современные гипотензивные, гиполипидемические, антиаритмические и другие препараты. Гипотензивные средства применяют как для снижения артериального давления, так и в качестве антиаритмических средств при лечении широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний. В список наиболее широко используемых в Казахстане гипотензивных лекарственных средств входит бисопролол (конкор).

Бисопролол по частоте развития лекарственных осложнений стабильно занимает одно из первых мест. Известны случаи летального отравления людей бисопрололом при ошибочном приеме, завышении доз в процессе лечения или с целью самоубийства. Токсические свойства, широкое применение бисопролола, наличие случаев летального отравления делают его потенциальным объектом судебно-химического исследования. Вопросы идентификации и количественного определения данного соединения в биологическом материале разработаны недостаточно.

Неблагоприятные побочные эффекты токсического характера развиваются, как правило, на фоне повышенных концентраций препарата в крови при использовании их в дозах, превышающих рекомендуемые, при случайном попадании в сосудистое русло, при быстром введении препарата у пациентов с аритмией, желудочковой экстрасистолией, выраженной брадикардией, острой сердечной недостаточностью, гипогликемией, затруднением дыхания, бронхоспазмом, анафилактическим шоком вплоть до смертельного исхода.

Химико-токсикологический анализ (ХТА) лекарственных средств, представляющих интерес с точки зрения потенциальной опасности для человека при острых отравлениях и преступных деяниях, достаточно трудоемкий процесс, где в качестве объектов исследования фигурируют биологические объекты (биожидкости, секреты, органы и т.п.).

Увеличение номенклатуры лекарственных препаратов, комбинирование интоксикации, процессы метаболизма их в организме и трупе, ограниченное количество объектов, поступающих на исследование, определяют необходимость внедрения в судебно-химическую экспертизу (СХЭ) и ХТА высокочувствительных и специфичных методов анализа.

Достоверные результаты медико-криминалистических исследований вещественных доказательств с места преступления на наличие токсикантов являются важной составляющей уголовного расследования.

Очень важным в аналитической токсикологии является подготовка проб, включающая выделение (изолирование), очистку и концентрирование токсических соединений, правильное использование возможностей различных методов анализа, их рациональное сочетание и умение интерпретировать результаты.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) в сочетании с УФ-спектрофотометрией позволяет идентифицировать многие лекарственные вещества, имеющие поглощение в УФ области, в том числе и бисопролол.

Однако, применение метода ТСХ-УФ-спектрофотометрия ограничивается отсутствием в практике судебной химии и токсикологической химии оптимальных методик подготовки проб биологических объектов, особенно для высокой степени излечения В-адреноблокаторов, обеспечивающих наилучшую эффективность экстракции и характеризующихся невысокой трудоемкостью.

В этой области анализа очень большое значение имеет качество измерений, т.е. совокупность свойств, обуславливающих получение результатов с требуемыми точными характеристиками, в необходимом виде и в установленные сроки.

Целью исследования является разработка методик идентификации и количественного определения бисопролола методом ТСХ-УФ-спектрофотометрии.

Материалы и методы. В работе использованы лекарственная субстанция бисопролола (British Pharmacopoeia, 2009.-V.I&II); растворители и реактивы категории «х.ч.» и «ч.д.а.». Для хроматографического разделения бисопролола от сопутствующих веществ использован комплект приборов для тонкослойной хроматографии: хроматографическая камера размером 235х170х120, хроматографические пластинки «Сорбфил ПТСХ-УФ» (ЗАО «Сорбфил», Россия); УФ-

хроматоскоп, микрокапилляры объемом 2 мкл (Россия). Количественное определение проведено на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ, Россия), в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Результаты и их обсуждение. Нами предложена методика ТСХ-УФ-спектрофотометрии для обнаружения и количественного определения бисопролола из мочи. Сущность методики заключается в предварительном разделении бисопролола от сопутствующих эндогенных веществ, имеющихся в моче, методом ТСХ. Далее зону адсорбции бисопролола элюируют и проводят количественное измерение препарата спектрофотометрией в УФ области спектра.

Пробоподготовку провели методом жидкость-жидкостной экстракции. Для этого было исследовано влияние различных растворителей на эффективность выделения бисопролола из биологической матрицы следующими растворителями: хлороформ-изопропиловый спирт, хлороформ-этиловый спирт, хлороформ-ацетон в соотношениях 8:2 (рН 10-11). В ходе исследований подобрана оптимальная смесь экстрагентов, состоящая из хлороформа и изопропилового спирта (рисунок 1).

С целью выбора условий хроматографирования, позволяющих достичь селективного разделения бисопролола, изучено его хроматографическое поведение в разных системах растворителей.

Подвижная фаза, используемая для ТСХ-скрининга бисопролола подбиралась по элюотропному ряду Шталья и по рекомендации Международной ассоциации токсикологов для веществ, в ряду которых часто используются такие растворители, как толуол, ацетон, спирты метиловый, этиловый, изопропиловый, диоксан и хлороформ. Бисопролол, который имеет в своей структуре третичный азот атома, дает хорошую детекцию с реактивом Драгендорфа, что соответствует международным рекомендациям TIAFT (The International Association of Forensic Toxicologists), FDA (Food and Drug Administration) и Центра судебной медицины Республики Казахстан.

С целью выбора оптимальной подвижной фазы из общей хроматографической системы экспериментально подобраны следующие растворители: хлороформ-этиловый спирт (40:10), хлороформ-н-бутанол-раствор аммония гидроксида конц. (35:14,5:0,5), хлороформ-спирт изопропиловый-этилацетат-раствор аммония гидроксида конц. (40:9,5:0,5), толуол-ацетон-спирт этиловый-раствор аммония гидроксида конц. (45:45:3:2). Подвижность бисопролола в общих системах растворителей оценивали на основании величин R_f, которые находятся в пределах 0,20,8, что показывает эффективность данных систем растворителей (таблица 1).

Таблица 1 - Значения Rf бисопролола в различных системах растворителей

Бисопролол имеет оптимальные значение Rf в пределах 0,5 в экспериментально подобранной подвижной фазе, состоящей из хлороформа-спирта изопропилового-этилацетата- раствора аммония гидроксида конц. (40:9,5:0,5 по объему). Пятна при этой фазе разделяются селективно, компактно, без «хвостов».

Пластину обрабатывали реактивом Драгендорфа. Затем слой сорбента из непроявленной зоны, расположенный параллельно окрашенному пятну в зоне хроматографической пластины, снимали и бисопролол элюировали 0,1 М кислотой хлороводородной (рисунок 2).

Спектр поглощения полученного раствора измеряли в области 200-400 нм с помощью спектрофотометра в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Спектр извлечения характеризуется наличием максимума поглощения при длине волны 278±2 нм, что соответствует данным литературы. (рисунок 3).

111

Были проведены количественные измерения бисопролола, выделенного из исследуемых образцов не менее 5 раз. В результате полученных измерений по предлагаемой нами методике определено 65,5±2,19 мкг/мл бисопролола в биологической жидкости, что составляет 81,88 % при относительном стандартном отклонении RSD 3,18 %.

Выводы. Разработана методика ТСХ-УФ-спектрофотометрии для обнаружения и количественного определения бисопролола, выделенного из мочи. Для очистки от сопутствующих веществ вытяжку с содержанием бисопролола хроматографировали подвижной фазой, состоящей из хлороформа-спирта изопропилового-этилацетата-раствора аммония гидроксида конц. (40:9,5:0,5 по объему). Абсорбционную зону бисопролола на хроматографической пластине далее элюировали и определяли методом УФ-спектрофотометрии при длине волны 278 нм. Методика показала высокую воспроизводимость и точность, которая позволяет рекомендовать ее для химикотоксикологических исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Клиническая токсикометрия острых отравлений / В. Н. Дагаев, Е. А. Лужников, В. И. Казачков. - Екатеринбург : Чароид, 2001. - 182 с
2. Смертельные дозы и концентрации некоторых лекарственных веществ в биологических объектах / А. Ф. Фартушный // Судебно-медицинская экспертиза. - 1999. - Т. 42, № 5. - С. 16-19.
3. Барам Г.И. с соавторами, 2002; 2003; 2005; Федорова Г.А., Кожанова Л.А., 2007
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств под ред. проф. А. Н. Миронова. Том I. / М.: Гриф и К, 2013
5. Comparison of the analysis of в-blockers by different techniques / E. Pujos et al. // Journal of Chromatography B. 2009. № 877. P. 4007-4014