Исследование острой токсичности мази с маслом из семян винограда

АННОТАЦИЯ

На основе выделенных биологических активных веществ из семян винограда, произрастающего на юге Казахстана, разработана мазь. Полученная мазь содержит виноградное масло, мятное масло, экстракт ромашки, обладает противовоспалительным действием. Целью исследования явилось изучение влияния активных веществ мази с маслом из семян винограда на организм лабораторных животных, установление характера общетоксического действия мази и оценка безопасности препарата. В результате проведенных исследований определена острая токсичность мази. Установлено, что препарат является малотоксическим веществом (макро- и микроскопическое изучение внутренних органов подопытных животных показало отсутствие токсического эффекта мази при повторных апликациях в течение суток). Мазь не оказывает местнораздражающего действия при нанесении на кожу.

Ключевые слова: общетоксическое действие, мазь с маслом из семян винограда, фитопрепараты, оценка безопасности препарата.

Актуальность. Применение фитопрепаратов в медицинской практике особенно эффективно при хронических заболеваниях, можно проводить длительное лечение совместно с синтетическими лекарственными препаратами.

Из косточек винограда добывается очень ценное масло, во многих странах применяемое как лечебное средство. В семенах винограда содержится много жирного масла и дубильных веществ, в них обнаружены антоцианы, флавоноиды, полифенолы, лецитин и другие биологически активные вещества [1-3].

Перспективным направлением в развитии отечественного рынка фитопрепаратов является разработка технологии получения и изучение биологической активности масляных фитопрепаратов и лекарственных форм на их основе. На кафедре технологии лекарств ЮжноКазахстанской государственной фармацевтической академии проводятся исследования по комплексной переработке семян винограда сорта «Каберне» и получены масло виноградное, сухой экстракт, сорбент. На первом этапе было выделено виноградное масло методом экстракции органическим растворителем. Экстракцию проводили в аппарате Сокслет, затем растворитель (хлороформ) отгоняли под вакуумом. Выход масла определяли гравиметрическим методом [4]. Были исследованы показатели качества и безопасность масла виноградного [5]. На основе полученного масла разработана мазь, содержащая виноградное масло, мятное масло, экстракт ромашки на эмульсионной основе (эмульгатор Т-2, вазелин, вода, аэросил). Определены основные показатели качества мази с маслом из семян винограда (МСВ) [6].

Цель исследования: Определение влияния активных веществ мази на организм лабораторных животных, установление характера общетоксического действия мази с маслом семян винограда и оценка безопасности препарата.

Материал и методы исследования:

Предварительная оценка токсичности проводилась на ограниченном количестве животных. Все испытуемые дозы подбирались так, что каждая доза отличается от предыдущей в 2,0 раза, причем каждую дозу наносят только одному животному однократно. На предварительном этапе у всех животных отсутствовал токсический эффект. Предварительную ЛД50 при однократном нанесении установить не удалось, так как не было летальных исходов. На данном этапе исследования не выявлено также половых различий в чувствительности крыс к токсическому действию препарата.

Оценка острой токсичности осуществлялась по уровню смертности животных, динамике массы тела, внешнему виду, поведению, кожно-резобтивному, местно-раздражающему действию на кожу, состоянию шерстных покровов, потреблению пищи и воды, интенсивности и характеру двигательной активности, поведенческим реакциям, и результатам морфологических исследований.

В экспериментах использованы в качестве тест-системы - белые неинбредные крысы обоего пола массой 220 г ± 10% в количестве 48 особей. Выбор в качестве тест-систем крыс определяется рекомендациями по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [7].

Для микроскопических исследований готовили срезы внутренних органов и тканей умерщвленных и павших животных [8]. Для этого иссеченные части из органов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, дегидратировали в растворах этанола с восходящей концентрацией и заливали в парафиновые блоки. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5-7 микрон, которые окрашивали гематоксилин-эозином [9]. Из окрашенных срезов изготовлены микропрепараты на стеклах для микроскопии. Микроскопические исследования срезов тканей и внутренних органов проводили при помощи микроскопа прямого света DM2500 (Leica, Германия).

Для проведения исследования сформировали по две группы, состоящимися из 12 особей (6 самок, 6 самцов) с дробным, 4-х кратным нанесением мази [10].

I - животным наносили дозу 200,0 мг/см² четыре раза в сутки, всего 800,0 мг/см². II - контрольная группа, животным наносили дозу вазелина 200,0 мг/см² четыре раза в сутки, всего 800,0 мг/см^2.

В первые сутки изменения регистрировали каждый час, а в последующие 2 суток каждые 4 ч в дневное время. По истечении 3 суток оставшихся в живых животных наблюдали 14 суток для изучения отдаленных последствий с периодичностью регистрации изменений 1 раз/сутки.

Оценка динамики массы тела крыс представляет собой объективный показатель, часто используемый для интегральной характеристики общетоксического действия веществ. Крыс взвешивали перед началом эксперимента и на седьмые и четырнадцатые сутки. Взвешивание осуществляли утром до кормления.

У подопытных животных не наблюдалось снижения массы тела. Это указывает на отсутствие влияния мази при повторных аппликациях в течение суток на изменения массы тела.

Обязательным условием проведения испытания на «острую» токсичность является изучение показателей соматических реакций. Наблюдали за общим состоянием животных, интенсивностью и характером двигательной активности, частотой и глубиной дыхания, состоянием волосяного и кожного покровов, окраской слизистых оболочек, частотой дефекации, консистенцией кала, окраской мочи, частотой мочеиспускания, потребление корма и воды.

Проведенные исследования показали, все регистрируемые показатели у лабораторных животных при применении мази в течении 14 дней периода наблюдения не отличались от показателей в контрольной группе. Судорог у животных не наблюдалось. Кожно-резорбтивное и местно-раздражающее действие мази как в первые сутки после введения так и в последующие сроки наблюдения не выражено. Животные не погибали, видимых признаков интоксикации у них не наблюдали. Кожа на месте нанесения препарата была чистая, без признаков раздражения. За время наблюдения у всех животных начали отрастать волосы на выстриженных участках. Соматические показатели подопытной группы не отличались от показателей контрольной группы.

По окончании срока наблюдения после нанесения мази с МСВ выживших животных декапитировали и провели макроскопический осмотр, после чего производили забор материала для микроскопического исследования.

Макроскопическое исследование внутренних органов на 14 день после введения мази с МСВ не выявило каких-либо отклонений от контрольной группы. Расположение внутренних органов у подопытных животных было правильным, не отмечалось спаянности, увеличения или уменьшения размеров, кровоизлияний, некротических изменений.

Результаты гистоморфологического исследования органов животных после нанесения мази.

В миокарде патоморфологических изменений не выявлено. Равномерное кровенаполнение сосудов сердца, отсутствует гиперметрия кардиомиоцитов, поперечная исчерченность мышечных волокон сохранена.

Легкие представлены альвеолами округлой формы. Бронхи без явлений воспаления, содержат в просвете слизистый секрет. Легочная ткань полнокровная. Перибронхиальных лимфоузлов в состоянии гиперплазии и гипертрофии не определялось. Признаков малигнизации не отмечено.

Микроскопическая картина строения паренхимы печени соответствует здоровым животным. Трабекулярная и дольковая структура печеночной паренхемы хорошо выражена. Сосудистые элементы печени без изменений, обычного кровенаполнения. Печень полностью сохранила свою структуру и не имела признаков малигнизации. Г лиссонова капсула не изменена.

Гистологический анализ почек. Собственная фиброзная капсула тонкая. Паренхима не полнокровная, структурные элементы мозгового и коркового вещества обозначены хорошо. Клубочки почек нормального строения. Дистрофических изменений в проксимальных канальцах не отмечалось. Гистолимфоцитарных инфильтратов в корковом веществе не наблюдалось. Явлений воспаления и малигнизации не выявлено.

В мозговой части надпочечников клеточный состав не изменен, хромаффинные клетки обычного вида, венозные сосуды не увеличены. Соотношение клубочковой, пучковой и сетчатой зон надпочечников не нарушено. Дистрофических изменений в железистых клетках не наблюдалось, признаков малигнизации не отмечено.

Гистологический анализ брыжеечных лимфоузлов. Синусы определяются четко. Паренхима представлена темным корковым и светлым мозговым веществом. Корковое вещество содержит фолликулы со светлым центром размножения.

Капсула селезёнки не изменена. Разграничение между красной и белой пульпой сохранено четко. Клеточный состав соответствует контролю. Число макрофагов в красной пульпе не увеличено. Структура и размеры реактивного центра фолликулов не изменены.

Гистологический анализ семенников. Извитые канальцы семенников содержат клетки всех стадий сперматогенеза. Клетки Сертоли и Лейдига без признаков дегенерации. В яичниках и матке структурных изменений не выявлено.

Гистологический анализ желудочно-кишечного тракта. Со стороны желудка патологии не выявлено. Покровный эпителий слизистой сохранен. Собственная пластика слизистой оболочки полностью сохранена и не изменена. Кровеносные сосуды стенки желудка обычной формы и обычного кровенаполнения.

Строение кишечной стенки без изменений, соответствует норме. Серозная оболочка представлена одним слоем мезотелиальных клеток. Мышечный слой не изменен. Подслизистый слой представлен рыхлой-волокнистной соединительной тканью. Просветы сосудов умеренного кровенаполнения. Слизистый слой широкий. Ворсины и крипты покрыты цилиндрическим эпителием, с бокаловидными и каемчатыми клетками.

Анализ срезов кожи крыс с участков нанесения мази выявил неизмененную структуру кожи в фазе телогена и аногена. Четко прослеживаются эпидермис, собственно дерма и гиподерма. Волосяные фолликулы имели обычную структуру и различались в зависимости от фаз циклов роста волоса. У волосяного фолликула отмечаются луковица с сосочком, стержень с волосом, кутикула, внутреннее и внешнее корневое влагалище. В гиподерме отмечаются пластинчатые тельца Фатера-Пачини. Повреждений эпителия волосяных фолликулов и структуры волоса не обнаружено. Отсутствовали утолщения рогового слоя, не отмечено компенсаторной гиперкератинизации. Дерма не было повреждена, не содержала локальных инфильтратов как лейкоцитарными, так и лимфоидными клеточными элементами. Диффузная инфильтрация находилась в пределах показателей контрольных крыс. Жировые железы имели обычную структуру.

При гистологическом изучении у животных получавших мазь с виноградным маслом не было выявлено структурных изменений в органах.

Результаты микроскопического исследования органов животных после применения мази с дозой 800,0 мг/сутки показали отсутствие отличий от контрольной группы.

Выводы:

1. В результате проведенных исследований установлено, что мазь с маслом семян винограда при применении в течение суток и при повторных аппликациях в течение суток является малотоксическим веществом (ЛД50 не определена; макро- и микроскопическое изучение внутренних органов подопытных животных показало отсутствие токсического эффекта мази).

2. Мазь с виноградным маслом не оказывает местнораздражающего действия при нанесении на кожу в первые сутки после нанесения и в последующие сроки наблюдения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Л.І.Власик, Л.В.Сергеева. До біологічноі діі олій, отриманих із насіння гарбуза та кісточек винограду. // Матеріали науковоі конференціі «Наволишне середовище і здоро,я». - Чернівці: ЧМУ, 1993. - С.71
2. L.Boudier, Bernardi Mateoa P. Elaboration et utilization des produits secondaries de la Vinicaation “Bule Oliv”. - 1972. - Vol.46, N.504. - Р.124-147
3. Пирниязов А.Ж., Абдулладжанова Н.Г., Мавлянов С.М. и др. Полифенолы косточек Vitis vinifera //ХПС. - 2003.- №4. - С. 281-285.
4. Сагиндыкова Б.А., Анарбаева Р.М., И.А. Мартынова технологические параметры, влияющие на выделение масла из семян винограда // Фармация - 2013. - №4.- С. 32-34.
5. Сагиндыкова Б.А., Анарбаева Р.М., Сагинбазарова А.Б. Исследование качества и безопасности масла винограда // Материалы 1 Центрально-Азиатского научного форума «Клиническая фармакология: опыт, современное состояние, перспективы». Вестник АГИУФ - Алматы. - 2008. - № 4 (9). - С. 81.
6. Сагинбазарова А.Б. Качественное и количественное исследование мази с маслом из семян винограда // Медицинский журнал Западного Казахстана. - 2013. -№4 (40).- С. 18-20.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общей ред. Член-корреспондента РАМН, проф. Р.У.Хабриева, - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. - 832 с.
8. Wayt R., Maclarson T., Newman W. Histology. Modern principles and methods. - Elsevier. - 1996. - 323 p.
9. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.:Медицина.-1982.-304 с.
10. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия)/под ред.проф. И.В. Саноцкого.-М.:Медицина-1970.- 342 с.