Биоаналитическая методика количественного определения капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила в плазме крови

АННОТАЦИЯ

Целью данной работы являлась разработка и валидация методики количественного определения капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила в плазме крови. Количественное определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ) с масс-селективным детектированием(тройной квадруполь). Разработанная методика была валидирована по следующим валидационным характеристикам: селективность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов. Аналитический диапазон методики составил 10,0 нг/мл - 20000,0 нг/мл для капецитабина и 10,0 нг/мл - 400,0 нг/мл для 5-фторурацила в плазме крови. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для исследований фармакокинетики капецитабина.

Ключевые слова: капецитабин, 5-фторурацил, биоаналитическая методика, ВЭЖХ, валидация.

Введение

В литературе описаны различные методы определения капецитабина и его метаболитов в биологических жидкостях, в основном это методы ВЭЖХ с масс-селективным или УФ- детектированием [1-4]. В настоящее время метод ВЭЖХ широко применяется в фармацевтическом анализе. Данный метод включен в виде общих статей или их разделов в USP, BP, EP, ГФ XII, также метод ВЭЖХ активно применяется при количественном определении препаратов в биологических жидкостях.

В большинстве из опубликованных методик капецитабин и его метаболиты определяли методом ВЭЖХ с тандемным масс-селективным детектированием. Аналитические диапазоны составляли50-6000 нг/мл для капецитабина и50-5000 нг/мл для 5-фторурацила[2], 0.0500-10.0 мкг/мл для капецитабина и 0.0500-25.0 мкг/мл для его метаболитов[3]. При использовании метода ВЭЖХ с УФ детектированием для количественного определения капецитабина и его метаболитов в плазме крови предел количественного определения составил 0.025 мкг/мл, а аналитический диапазон концентраций 0.025-10 мкг/мл[4].

Данная работа была проведена с целью разработки более чувствительной, селективной и удобной в выполнении методики количественного определения капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила в плазме крови.

Материалы и методы

Пробо подготовку проводили методом осаждения белков метанолом.

Количественное определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, фотодиодноматричным и тандемным масс-спектрометрическим детектором. Подвижная фаза: вода, 0,1% муравьиной кислоты, 1ммоль/л формиата аммония / вода, 0,1% муравьиной кислоты, 1 ммоль/л формиата аммония.

Неподвижная фаза: хроматографическая колонка ZorbaxEclipse XDB-C18 75*4,6 мм 3,5 мкм при температуре 37оС.

Объем вводимой пробы составил 10 мкл. Время хроматографирования - 6,5 минут.

Условия детектирования были следующими:

  • 5-фторурацил - отрицательный режим ионизации, 129,15 m/z, напряжение на капилляре -5 кВ, распыляющий газ - 2 л/мин, осушающий газ - 20 л/мин, блок нагрева - 400°С, линия десольватации - 300°С.
  • Капецитабин - положительный режим ионизации, 360.1^244.1. 360,1 ^ 130,0, напряжение на капилляре 3,5 кВ, распыляющий газ - 2 л/мин, осушающий газ - 20 л/мин, блок нагрева - 400°С, линия десольватации - 300°С.

Время удерживания 5-фторурацила составило около 0,9 минуты.Время удерживания капецитабина - около 2,8 минуты.

Валидация методики

Валидацию биоаналитической методики проводили на основе Руководства по экспертизе лекарственных средств Том I ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ, 2013, а также Руководств FDA (Guidance for Industry: Bioanalytical method validation (draft). U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2013) и EMA (Guideline on validation of bioanalytical methods (draft).European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2014) последующим характеристикам: селективность; линейность;правильность (на уровнях inter-run, intra-run, inter-run, intra-run); прецизионность (на уровнях inter-run, intra-run, inter-run, intra-run); предел количественного определения; перенос пробы; стабильность растворов.

Селективность

Проводили анализ 7 образцов чистой плазмы, образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора капецитабина в диапазоне концентраций 10 нг/мл - 20000,0 нг/мл и 5- фторурацила в диапазоне концентраций 10 нг/мл - 400,0 нг/мл. На хроматограммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания капецитабина или 5-фторурацила.

Линейность

Проводили анализ 10 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора капецитабина до получения концентраций: 10 нг/мл, 20 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 500 нг/мл, 1000 нг/мл, 2000 нг/мл, 5000 нг/мл, 10000 нг/мл, 20000 нг/мл и 6 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора 5-фторурацила до получения концентраций 10 нг/мл, 20 нг/мл, 40 нг/мл, 100 нг/мл, 200 нг/мл, 400 нг/мл. По полученным значениям были построены калибровочные графики.

Полученный коэффициент корреляции соответствует нормам (не менее 0,99).

Правильность и прецизионность

Проводили анализ 4 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора капецитабина до получения концентраций: 10 нг/мл, 50 нг/мл, 10000 нг/мл, 20000 нг/мл.

Проводили анализ 4 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора 5- фторурацила до получения концентраций: 10 нг/мл, 20 нг/мл, 200 нг/мл, 400 нг/мл.

Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Исследование проводили в течение 1-ой последовательности (intra-run) и 2-ой последовательности (inter-run). Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (е, %),

Для расчета относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (е, %) на уровне inter-day использовались данные (n=10) полученные в течение 1-ой последовательности (intra- run) и 2-ой последовательности (inter- run).

Полученные величины относительного стандартного отклонения (прецизионность) и относительной погрешности (правильность) соответствуют нормам (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек).

Предел количественного определения

Предел количественного определения (ПКО) методики был установлен на основании данных линейности, правильности и прецизионности. За ПКО методики принималась минимальная концентрация капецитабина и 5-фторурацила в плазме, для которой возможно определение капецитабина и 5-фторурацила со значениями RSD и е не более 20 % в диапазоне линейной зависимости. Предел количественного определения методики составил 10,0 нг/мл для обоих веществ. Хроматограммы, демонстрирующие ПКО методики, приведены на Рисунках 1 и 2.

Стабильность

Стабильность была подтверждена для стандартных растворов капецитабина и 5- фторурациза (при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от -20°С до -25°С), кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 48 ч при анализе на следующий день при температуре 20 °С), на уровне концентрации 50 и 20000,0 нг/мл для капецитабина, 20 и 400,0 нг/мл для фторурацила. Образцы выдерживали 3 цикла заморозки- разморозки. Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10 %.

Перенос пробы

При последовательном вводе пробы с концентрацией капецитабина 20000,0 нг/мл и 5- фторурацила 400,0 нг/мл и чистой плазмы на хроматограмме чистой плазмы отсутствовали пики, соответствующие капецитабину и 5-фторурацилу. Перенос пробы отсутствовал.

Результаты и обсуждение

Разработанная методика количественного определения капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила в плазме крови является достаточно чувствительной и селективной согласно своим валидационным характеристикам. Аналитический диапазон методики составил 10,0 нг/мл - 20000,0 нг/мл для капецитабина и 10,0 нг/мл - 400,0 нг/мл для 5-фторурацила. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для исследований фармакокинетики капецитабина. Предел количественного определения методики составил 10,0 нг/мл для обоих веществ. По данному показателю разработанная методика превосходит большинство опубликованных методик количественного определения капецитабина и его метаболитов в плазме крови. Также она является удобной в выполнении и менее затратной.

Выводы

Разработанная биоаналитическая методика количественного определения капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила в плазме крови может быть использована для определения фармакокинетических параметров капецитабина и 5-фторурацила при проведении исследований фармакокинетики и биоэквивалентности препаратов капецитабина.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Montange D1, Berard M, Demarchi M, Muret P, Piedoux S, Kantelip JP, Royer B. An APCI LC- MS/MS method for routine determination of capecitabine and its metabolites in human plasma. J Mass Spectrom. 2010 Jun;45(6):670-7. doi: 10.1002/jms.1759.
  2. Deenen MJ, Rosing H, Hillebrand MJ, Schellens JH, Beijnen JH. Quantitative determination of capecitabine and its six metabolites in human plasma using liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci. 2013 Jan 15;913-914:30-40. doi: 10.1016/ j.jchromb.2012.11.033. Epub 2012 Dec 7.
  3. Xu Y, Grem JL. Liquid chromatography-mass spectrometry method for the analysis of the anticancer agent capecitabine and its nucleoside metabolites in human plasma. J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci. 2003 Jan 5;783(1):273-85/
  4. Zufia L, Aldaz A, Giraldez J. Simple determination of capecitabine and its metabolites by liquid chromatography with ultraviolet detection in a single injection. J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci. 2004 Sep 25;809(1):51-8.
Год: 2015
Город: Шымкент
Категория: Медицина