АННОТАЦИЯ
Метронидазол является высокоактивным антимикробным лекарственным средством, обладающим широким спектром действия в отношении простейших, споро- и неспорообразующих облигатных анаэробных бактерий (Падейская Е.Н., 2010; Машковский М.Д., 2012). Появление на фармацевтическом рынке новых лекарственных форм метронидазола требует совершенствования методов контроля его качества. Для контроля качества метронидазола в субстанции и лекарственных формах используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который имеет некоторые недостатки в виду трудоемкости пробоподготовки, использования в качестве подвижной фазы токсичных и дорогостоящих растворителей и т.д. (Теплых А.Н., 2009; ГФ РК, 2008; ГФ РФ,2007; USP 30,32,2007; Br.Ph,2009).
Нами оптимизирована методика ВЭЖХ-анализа метронидазола в субстанции и лекарственных формах с целью ее дальнейшей унификации.
Ключевые слова: метронидазол, контроль качества, ацетонитрил, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), унификация, валидация.
Цель - оптимизация методики анализа метронидазола в субстанции и лекарственных формах с применением ВЭЖХ.
Материалы и методы. Объектами исследования были субстанция (ГФ РК, т.2, стр. 316) и лекарственные препараты метронидазола: таблетки (АНД РК 42-980-10), гель (АНД РК 42-1955-11), инфузионный раствор (АНД РК 42-4185-17), суппозитории вагинальные (АНД РК 42-1859-10), вагинальные таблетки (АНД РК 42-3715-11), ацетонитрил (gradient grade, Scharlau), вода очищенная, кислота фосфорная концентрированная (х.ч.), калия дигидрофосфат (х.ч.)..В работе использован хроматограф Agilent 1260, оснащенный четырех канальным градиентным насосом, автосамплером, термостатом колонок и образцов, фотометрическим детектором, под управлением программного обеспечения ChemStation (ver. B.04.03). Скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин., объем вводимой пробы - 20 мкл., время хроматографирования - 8 мин., детектирование: длина волны детектирования - 320 нм., время удерживания метронидазола - 5,7 мин.
Для пробоподготовки применяли вортекс-шейкер Reax top (Heidolph, Германия), орбитальный шейкер (Biosan OS20, EC), центрифугу SL 16 (Thermo Scientific, США). В работе использовали портативный рН/мВ-метр 330i (WTW, Германия), аналитические весы (A&D GR-200, Япония), дозаторы переменного объема «Ленпипет Дигитал» 10-100 мкл и 100-1000 мкл (Россия).
Результаты и их обсуждение. Экспериментально подобраны условия хороматографическо- го анализа метронидазола в субстанции и лекарственных формах. В качестве оптимальной подвижной фазы была выбрана смесь раствора 0,1 М дигидрофосфата калия рН 6,4 и ацетонитрила в соотношениях 85:15 (по объему). В описанных выше условиях хроматографирования время удерживания метронидазола составляет 5,7 мин.
Проведена валидация разработанной методики по таким показателям как: селективность, линейность, правильность и прецизионность (на уровне intra-day и inter-day), перенос пробы, предел количественного определения, стабильность растворов на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA и EMA, а также «Руководства по экспертизе лекарственных средств» (Барам Г.И. и др.,2003; Рейхард Д.В. и др. 2005; Эпштейн Н. А. и др., 2005).
Для определения специфичности проводили анализ 5 образцов стандартного растворов метронидазола в диапазоне концентраций 56,0-84,0 мкг/мл. На хроматограммах стандартных образцов не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания метронидазола.
Линейностьизмеряли на 7 стандартных растворах концентраций: 56 мкг/мл, 59,5 мкг/мл, 63 мкг/мл, 70 мкг/мл, 77 мкг/мл, 80,5 мкг/мл, 84 мкг/мл. По полученным значениям построены калибровочные графики, коэффициент корреляции которых составил r2 = 0.99952.
Правильность и прецизионность методики определяли на 3-х образцах с прибавлением стандартного раствора метронидазола до получения концентраций: 56 мкг/мл, 70 мкг/мл, 84 мкг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Исследование проводили в течение 1 -го дня (intra-day) и 2-го дня (inter-day). Для полученных значений концентраций величина относительного стандартного отклонения (RSD, %) составляет 0,28, относительная погрешность методики (е, %) - 1,018.
Стабильность определена для стандартных растворов метронидазола (при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2 до 8 оС), кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 ч при анализе на следующий день) - на уровнях концентрации 56 мкг/мл 56 нг/мл и 84 мкг/мл. Площадь пика при повторных анализах не менялась более, чем на 10%.
ВЫВОДЫ:
Оптимизированы условия и разработана методика хроматографирования метронидазола в субстанции и лекарственных препаратах. Результаты валидации разработанной методики позволяют рекомендовать ее в практике испытательных лабораторий для контроля качества и определения фармацевтической биоэквивалентности лекарственных препаратов метронидазола.
ЛИТЕРАТУРА
- 1. Государственная фармакопея Республики Казахстан.-Алматы: Издательский дом «Жибек жолы», 2008.- Т.1.- 592 с.
- 2. Государственная фармакопея Республики Казахстан.-Алматы: Издательский дом «Жибек жолы», 2009.- Т.2.- 791с