АННОТАЦИЯ
Разработана методика контроля качества жидкого экстракта «Урглисал» по флавоноидам с использованием методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) и дифференциальной УФ- спектрофотометрии. На хроматограмме идентифицированы индивидуальные флавоноиды: рутин Rf=0,45 и кверцетин Rf=0,78. Разработана методика УФ-спектрофотометрии, где содержание суммы флавоноидов в жидком экстракте «Урглисал» составляет в среднем 0,98 %. Статистическая
обработка результатов анализа показала, что относительная ошибка среднего результата разработанной методики не превышает ±1,65.
Ключевые слова: флавоноиды, рутин, кверцетин, хроматографирование, жидкий экстракт, Glycyrrhiza glabra L., Salvia officinalis L. Urtica dioica L.
Введение. На основе местного сырья солодки голой - Glycyrrhiza glabra L., шалфея лекарственной - Salvia officinalis L. и крапивы двудомной - Urtica dioica L. проведены исследования по разработке технологии комбинированного препарата - жидкого экстракта «Урглисал», который даст возможность увеличить арсенал отечественных лекарственных препаратов с противовоспалительной активностью. По результатам предварительных исследований химического состава было выявлено, что жидкий экстракт также как и сырьё содержит ряд биологически активных соединений (БАС): флавоноиды, терпеноиды, глицирризиновую кислоту, дубильные вещества, аминокислоты, витамины, макро и микроэлементы. Для стандартизации жидкого экстракта нами в качестве основных БАС были выбраны флавоноиды и глицирризиновая кислота, которые по литературным данным обладают противовоспалительными свойствами и обуславливают терапевтическую его активность [1].
Цель исследования. Разработка методик контроля качества жидкого экстракта «Урглисал» по флавоноидам с использованием методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) и дифференциальной УФ-спектрофотометрии, ставших уже традиционными в их анализе. При разработке методики количественного анализа используется свойство флавоноидов образовать комплексное соединение с алюминия хлоридом, что приводит к смещению максимума спектра поглощения в видимую область, которое даёт возможность определять их даже в присутствии других фенольных соединений. При этом используется раствор сравнения, содержащий те же компоненты, что и испытуемый, за исключением алюминия хлорида, и вследствие чего спектр приобретает четкий вид с ясно выраженным максимумом поглощения.
Методы исследования. Изучение содержания флавоноидов в жидком экстракте проводили методом ТСХ с использованием пластинки «Silufol UV-254» (Чехия) и —Sorbfil” ПЭТФ (10х10) УФ- 254 (силикагелъ СТХ-1БЭ), в качестве системы растворителей были использованы: хлороформ - метанол (19:1); хлороформ-метанол (9:1); хлороформ-метанол (4:1); н - бутанол-пиридин- вода (6:4:3), спирт-толуол (1:3), спирт-толуол(2:3). Наилучшее разделение флавоноидных соединений наблюдалось в системе этиловый спирт-толуол (2:3). В качестве детектора был использован 5% спиртовый раствор алюминия хлорида и 10% раствор натрия гидроксида (пятна ярко-желтого цвета с желтой флуоресценцией в видимой области УФ-света). Хроматографирование осуществляли следующим образом: 0,01 мл раствора микропипеткой наносят на стартовую линию пластинки «Silufol UV 254» (ЧССР) (15»15см) в виде полосы длиной 1 см. Рядом наносят в виде точки 0,005 мл 0,1% раствора стандартного образца рутина и кверцетина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин, помещают в камеру, насыщенную парами смеси растворителей, и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей достигает линию «финиша», ее вынимают из камеры, высушивают в вытяжном шкафу в течение 2 мин и просматривают в УФ-свете при Z=360 нм. На уровне пятен РСО рутина и кверцетина появляются желтые пятна. Далее пластинку обрабатывают 5% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревают в течение 2-3 мин в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. При этом пятна приобретают ярко-желтую окраску и желтую флуоресценцию в видимой области УФ-света. При проявлении хроматограмм в качестве детектора был использован 5% спиртовый раствор алюминия хлорида и 10% раствор натрия гидроксида. Были идентифицированы индивидуальные флавоноиды: рутин Rf=0,45 и кверцетин Rf=0,78.
Методика количественного определения суммы флавоноидов: 5 мл препарата помещают в колбу со шлифом вместимостью 25 мл, доводят объём 70% спиртом этиловым и перемешивают (р-р А). 1 мл полученного раствора А помещают в колбу со шлифом вместимостью 25 мл добавляют 5 мл 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирта этилового, через 10 мин прибавляют 2 мл 5% раствора уксусной кислоты в 70% спирта этилового, доводят объём раствора 70% этиловым спиртом до метки и перемешивают. Через 30 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора РСО рутина, 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирте этиловом, 2 мл 5% раствора уксусной кислоты в 70% спирте этиловом, доведенный до 25 мл 70% спиртом этиловым.
Количественное содержание суммы флавоноидов в % x в пересчёте на рутин рассчитывали по следующей формуле:
m _ m -1 • 25 • 25 • D • 100 _ m • d • 5
50•100 • D0 •m -1 D0 •2
где: D0 - оптическая плотность раствора PCO рутина; D - оптическая плотность испытуемого раствора; m0 - масса РСО рутина, в граммах; m - масса препарата, в граммах.
Приготовление раствора РСО рутина: около 0,025 г (точная навеска) РСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-1350С в течение 3 часов, растворяют в 70% спирте в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 70% спиртом до метки и перемешивают. Помещают 1 мл полученного раствора в мерную колбу вмести-мостью 100 мл, доводят до метки 70% спиртом и перемешивают.
Результаты проведенных исследований и метрологические характеристики УФ- спектрофотометрической методики анализа жидкого экстракта «Урглисал» представлены в таблице.
Таблица - Результаты количественного определение суммы флавоноидов в жидком экстракте и метрологическая характеристика методики анализа(при f=4; t=2,78; P=95%)
|
№ |
Xi,% |
Х% |
S2 |
S |
A X |
A Х |
±e,% |
|
1 2 3 4 5 |
0,97 0.97 0,98 0,99 1,00 |
0,982 |
0,00017 |
0,0130 |
0,03614 |
0,0162 |
1,651 |
Как видно из таблицы содержание суммы флавоноидов в жидком экстракте «Урглисал» составляет в среднем 0,98 %. Статистическая обработка результатов анализа показала, что
относительная ошибка среднего результата разработанной методики не превышает ±1,65. Продолжительность методики определения - около двух часов.
Выводы. В результате проведенных исследований разработаны простые и доступные для внедрения в практику аналитических лабораторий фитохимических произ-водств, методики качественного (ТСХ) и количественного анализа (дифференциальная спектрофотометрия в УФ- области спектра) флавоноидов в жидком экстракте «Урглисал», которые будут включены в проект временной фармакопейной статьи на препарат и рекомендованы для «сквозной» стандартизации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блинков И. Л. Лекарственные растения в клинике. - М.: Знание, 1983. - 64с.