Исследование химического состава жидкого экстракта «Гемостат»

АННОТАЦИЯ

Статья посвящена химическому изучению жидкого экстракта —Гемостат”, которая состоит из надземный частей трав горца птичьего и перечного и листьев крапивы. Были изучены биологически активные вещества как флавоноиды: рутин, кверцетин. Изучен макро и микроэлементный, аминокислотный состав и содержание витамин K₁.

Ключевые слова: экстракт, гемостат, макро- и микроэлементы, листья крапивы.

Одним из основных научных направлений кафедры фармацевтической химии является разработка новых лекарственных препаратов на основе растительных ресурсов Республики Узбекистан. В настоящее время разработаны и стандартизированы ряд галеновых препаратов на основе таких растений как, горец перечный, горец птичей, эрва шерстистая, зверобой шероховатый, одуванчик лекарственный, календула и др. Получение положительных и новых результатов по изучению биологически активных веществ (БАВ) и стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов привело еще к более глубокому изучению и получению новых галеновых препаратов, одним из которых является жидкий экстракт «Гемостат».

Жидкий экстракт был получен по методу ВНИИФА из местного растительного сырья трав горцев перечного- Роіудопит hydropiper L., птичьего- Polygonum aviculare L и листьев двудомной крапивы- Urtica dioica..

Настоящая работа посвящена исследованию БАВ жидкого экстракта —Гемостат” состоящих из растений широко распространенного на территории Республики Узбекистан.

Экспериментальная часть При разработке методики определения витамина К1 в жидком экстракте крапивы была изучена возможность использования ВЭЖХ, ранее разработанной для анализа настойки горца птичьего и жидкого экстракта горца перечного [6].

1.Определение витамина К₁

10 мл жидкого экстракта упаривали (до 1- 2 мл) и количественно переносили в делительную воронку, где проводили экстракцию с использованием воды очищенной и гексана, в соотношение 50:20, соответственно. Гексановый слой подвергали к фильтрации с использованием безводного Na₂SO₄, а водный слой повторно экстрагировали для полного высвобождения БАВ из изучаемого жидкого экстракта. Гексановые экстракты объединяли и упаривали до сухого остатка в роторновакуумном испарителе при температуре не выше 40⁰С. Сухой остаток количественно переносили в

мерную колбу емкотсью 25 мл, промывая метанолом. Метаноловый раствор пропускали через фильтр «Миллипор» с расмером пор 0,45 мкм и использовали в качестве испытуемого раствора.

Хроматографическое определение проводили с использованием ВЭЖХ системы Agilent Technologies 1200 series с УФ спектрофотометрическим детектором методом обращенно-фазовой хроматографии. Разделение осуществлялось на металлической колонке размером 150х3,0 мм, наполненная сорбентом Zorbax Eclipse XDB, с полимерно привитой фазой С 18, обеспечивающей специфическую селективность по отношению к витаминам группы К. Объем инжекции составлял - 20 мкл, скорость потока - 0,5 мл/мин, температура - 20⁰С. Элюирование проводили в изократическом режиме, состав подвижной фазы - метанол. Детектирование велось при длине волны 272 нм. Время анализа составило - 10 минут.

В качестве стандартного образца использовали 2-метил-1,4-нафтахинон (С₁₃Н₄₆О₂, M.r 450,68, Fluka Chemie AG CH -9471, Sigma-Aldrich, > 99% (HPLC)). РСО филлохинона готовили путем растворения вещества в метаноле и дополучения концентрации 4 мкг/мл.

Хроматограммы разделения представлены на рисунках 1 и 2.

2. Изучение макро- и микроэлементного состава

Для исследования элементного состава использовали масс - спектрометрический метод: ICP-MS (масс - спектрометр индукционно - связанной плазмы) АТ 7500. Методика определения заключается в следующем: 5 мл спиртовый фитоэкстракт выпаривают и помещают в термостойкую колбу и приливают 10 мл концентрированной азотной кислоты. Образец разлагают в микроволновой печи «Milestone» при программировании мощности от 250 до 500 Вт и температуры от 180 до 220⁰С. Полученный раствор фильтруют и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 мл и в дальнейшем используют для прямого ввода в спрей-камеру прибора ICP-MS. Условия анализа: мощность плазмы -1200 Вт; время интегрирования - 0,1 сек; скорость вращения перистальтического насоса - 0,1 об/сек. Остальные параметры прибора установлены в процессе настройки и неизменны в течении между периодами проведения технического обслуживания. В качестве стандарта используют мультиэлементный стандартный раствор с содержанием целевых компонентов 1,0 мг/л.

3..Изучение аминокислотного состава.

Количественное определение спирторастворимых белков в жидком экстракте проводили спектрофотометрическим методом, который основан на способности ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Таким образом, измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, можно судить о

200количестве белка, присутствующего в растворе. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-46. Используя спектрофотометрический метод анализа, установили содержание спирторастворимого [8] белка (протаминов) составило 58мг/мл (5,8%).

Для определения качества белка спиртовый раствор упаривали на роторном испарителе и затем остаток раствора сушили. Брали навеску мг гидролизовали 5,7 Н соляной кислотой при 110⁰С в течение 24 часов в вакуумных условиях. Гидролизат упаривали и отдавали на определение аминокислотного состава. Анализ проводили на анализаторе Т-339. Результаты анализа приведены в таблице 1.

Состав отличается наличием всех незаменимых аминокислот (*) -

Обсуждение результатов. Проведены исследования по апробации условий хроматографирования и изучению количественного содержания витамина К₁ в комбинированном жидком экстракте «Гемостат» с использованием методом ВЭЖХ. На основании ВЭЖХ исследований было установлено, что количественное содержание витамина К₁ в жидком экстракте «Гемостат» составляет 1,45 мкг/мл. На основе полученных результатов далее будут проводится работы по унификации разработанной методики ВЭЖХ для идентификации и количественного анализа витамина К1 в лекарственных растениях произрастающих в Республике Узбекистан.

Таким образом, на основании проведенных исследований разработана сквозная методика качественного и количественного определения рутина и кверцетина в исследуемом образце с использованием метода ВЭЖХ. Результаты, которых приведены ниже.

В результате проведенных исследований было выявлено, что жидкий экстракт содержит все необходимые макро и микроэлементы, среди которых наибольшее количество составляют: магний- 120,0 мг/л, кальций - 82,0 мг/л, натрий - 53,0 мг/л, железо - 13,0 мг/л, цинк - 6,6 мг/л, хром - 3,7 мг/л, марганец - 1,7 мг/л. Необходимо отметить, вышеуказанные элементы относятся к эссенциальным, то есть жизненно - необходимым элементам.

Состав сбалансирован заменимыми аминокислотами. Следует отметить, что из литературных данных известно, что белки (пептиды) определённым образом влияют на сворачиваемость крови.

Выводы.

По результатам химического изучения на содержание БАВ было установлено, что жидкий экстракт «Гемостат» содержит витамин К1, флавоноиды, аминокислоты, а также макро - и микроэлементы (магний, кальций и натрий). При определении флавоноидов в жидком экстракте составило количественное содержание рутина 0,72 % а кверцетин 0,035 %, соответственно.

Результаты изучения метрологической характеристики разработанной методики показали, что

201

относительная ошибка среднего результата составила ± 1,29 % и ±1,96 %, что соответствует требованиям, предъявляемым инструментальным методам анализа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Высочина Г.И. Динамика содержания и компонентного состава флавоноидов Polygonum aviculareL. //Раст. Ресурсы.1999.-Т. 35, вып.3. С. 67-74.
2. Высочина Г.И. Югланин и гиперозид - основные флавоноловые гликозиды горца птичьего // Тр. I Всерос. конф. по бот ресурсоведение. СПб., 1996. С 214.
3. Николаева Г.Г., Лаврентьева М.В., Николаева И.Г. Фенольные соединения различных видов Polygonum // Химия природ. соедин. -Ташкент, 2009.-№5. С.-616-617.
4. Государственная фармакопея СССР.-XI изд.-М.: Медицина, 1990.-Вып. 2. 390 с.
5. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Трава горца птичьего. -Ташкент, 1998.- Т.1.- С. 507.
6. Юнусходжаева Н.А., Бекчанов Х.Н. Абдуллабекова В.Н. Разработка ВЭЖХ методики определения витамина К1 в травах горца птичьего и перечного //Фармацевтический журнал. - Ташкент, 2006.-№ 4.-С. 37-40.
7. Yunuskhodjaeva N.A., Abdullabekova V.N., Eshbakova K.A. Licviritine and cynnarozide from Polygonum aviculare L // 7-th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds: Abstracts. -Tashkent, Uzbekistan, 2007.-P. 353.
8. Девени, Я. Гергей. Аминокислоты, пептиды и белки. Издательство « Мир» Москва 1976г с 355.